[發明專利]家蠅抗藥性檢測試劑盒及其專用引物

無效

• 申請號: 201110197109.5
• 申請日: 2011-07-14
• 公開（公告）號: CN102242217A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 李春曉;趙彤言;董言德;汪中明;郭曉霞;劉美德;張映梅;邢丹
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種家蠅抗藥性檢測試劑盒及其專用引物。

背景技術

家蠅(Musca?domestica)是許多疾病的潛在媒介，是65種以上人或動物胃腸疾病的機械傳媒，如痢疾，胃腸炎，傷寒，肺結核等。滅蠅雖然強調以環境治理為主，但噴灑化學殺蟲劑仍然是常用的方法，特別在垃圾集散地，如生活小區或菜市場的垃圾箱、垃圾清潔站，各區垃圾中轉站及大中型垃圾填埋場等地方，用空間或滯留噴灑復配及混配的擬除蟲菊酯類殺蟲劑來控制蠅類密度。由于廣泛使用相對單一的化學藥物防制，用藥頻繁，而家蠅生活世代又較短，因此，近年來家蠅抗藥性問題日漸突出，引起廣泛關注。研究表明家蠅對氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯等均產生了不同程度抗性。

昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性主要是擊倒抗性(knockdown?resistance，kdr)，kdr基因在家蠅對擬除蟲菊酯的抗性中具有重要作用。擬除蟲菊酯的作用靶標主要是昆蟲電壓依賴性神經細胞膜上的鈉離子通道，離子通道上的作用靶點對殺蟲劑降低了敏感性而產生擊倒抗性，因此擊倒抗性不同于代謝抗性，不能被酯酶或多功能氧化酶的抑制劑所降低。通過比較敏感、抗性及高抗性家蠅的部分及全部鈉通道序列，發現para型鈉通道Vssc1基因的L1014F(亮氨酸到苯丙氨酸)即CTT→TTT的突變及M918T(甲硫氨酸到絲氨酸)即ATG→ACG和擊倒抗性相關。我國也多次報道在多省市的野外家蠅擬除蟲菊酯抗性個體中發現L1014F的突變。

kdr基因可以作為昆蟲對擬除蟲菊酯產生抗性的一個分子標記，通過監測kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結構中的狀態。Huang等(2004)用特異性等位基因PCR方法，對采自丹麥農場的14個家蠅野外種群進行kdr基因頻率的檢測，在所有種群中均檢測到kdr純合子及雜合子，且kdr頻率與一定劑量的除蟲菊素或生物芐呋菊酯(均加PBO)作用下的存活個體比率呈正相關。曹曉梅等(2005)用特異性等位基因PCR法檢測了北京、天津、張家口共17個野外種群家蠅個體kdr等位基因型，顯示家蠅野外種群的kdr基因頻率在8％～56％之間，并且發現LD₅₀為代表的溴氰菊酯抗性與家蠅kdr等位基因頻率之間存在正相關關系。研究說明Kdr基因可以作為家蠅對擬除蟲菊酯產生抗性的一個分子標記，通過監測kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結構中的狀態，可以預測抗性的發生和發展。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種檢測家蠅中kdr基因突變位點的引物。

本發明提供的引物，由引物組A和引物組B組成：

所述引物組A包括引物2和引物3，所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列3；

所述引物組B包括引物2和引物4，所述引物2和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列4。

所述引物組A還包括引物1，所述引物組B還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1。

所述引物組A和所述引物組B為獨立包裝；

所述引物組A中所述引物1、引物2和引物3的質量比為1∶2∶1；

所述引物組B中所述引物1、引物2和引物4的質量比為1∶2∶1；

所述突變位點為L1014F。

本發明的第二個目的是提供一種檢測家蠅中kdr基因突變位點的PCR試劑。

本發明提供的試劑，由試劑A和試劑B組成；

所述試劑A由所述引物組A和PCR緩沖液組成；

所述試劑B由所述引物組B和PCR緩沖液組成；

所述各引物組中各引物在對應的所述PCR試劑中的濃度均為0.4uM。

所述突變位點為L1014F。

PCR緩沖液為試劑T，購自寶生物工程有限公司，產品號DR011。

本發明的第三個目的是提供一種制備檢測家蠅中kdr基因突變位點的試劑的方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：

1)分別將所述的引物中的所述引物組A和所述引物組B進行獨立包裝，得到獨立包裝引物組A和獨立包裝引物組B；

2)再將步驟1)得到的獨立包裝引物組A和步驟1)得到的獨立包裝引物組B進行包裝，得到的試劑。

所述突變位點為L1014F。

由所述方法制備得到的試劑也是本發明保護的范圍。

本發明的第四個目的是提供一種檢測家蠅中kdr基因突變位點的試劑盒。