[發(fā)明專利]一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110196960.6
• 申請(qǐng)日: 2011-07-14
• 公開（公告）號(hào): CN102876745A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉省偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北大方正集團(tuán)有限公司;北大國際醫(yī)院集團(tuán)重慶大新藥業(yè)股份有限公司;北大國際醫(yī)院集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12P17/02
• 分類號(hào): C12P17/02;C12R1/465
• 代理公司: 北京天昊聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11112
• 代理人: 丁業(yè)平;張?zhí)焓?/td>

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物的方法，特別涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法。

背景技術(shù)

利普司他汀(lipstatin)由毒三素鏈霉菌(Streptomyces?toxytricini)經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示，其經(jīng)過氫化反應(yīng)合成新型減肥藥奧利司他，其結(jié)構(gòu)如式(Ⅱ)所示。奧利司他是長效和強(qiáng)效的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，它通過與胃和小腸腔內(nèi)胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性絲氨酸部位形成共價(jià)鍵使酶失活。食物中的脂肪不能分解為游離脂肪酸，因而脂肪不能被吸收、利用，從而減少熱量攝入，控制體重。奧利斯他是第一個(gè)胃腸道脂肪酶抑制劑，也是目前唯一的不進(jìn)入血液、不作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的減肥藥，它通過阻斷30％膳食脂肪被人體吸收達(dá)到減肥目的。

奧利司他目前有兩種生產(chǎn)工藝，一種是全合成法，另一種是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生利普司他汀，通過氫化獲得奧利司他。全合成法工藝過程復(fù)雜、產(chǎn)率低、環(huán)保壓力大，生產(chǎn)成本高。目前，行業(yè)內(nèi)大多數(shù)生產(chǎn)奧利司他的方法均為由發(fā)酵產(chǎn)生的利普司他汀經(jīng)氫化獲得。

在利普司他汀發(fā)酵生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)菌菌絲體自身特性以及發(fā)酵培養(yǎng)基的流體特性決定了其發(fā)酵液粘度較大，在菌絲生長旺盛期耗氧較快時(shí)，發(fā)酵液的溶氧將處于較低狀態(tài)，供氧不足，影響菌絲生長和產(chǎn)物合成。

載氧體(Oxygen-vectors)(或稱氧載體)是一種與水不互溶、對(duì)微生物無毒、能有效提高發(fā)酵液溶氧能力的有機(jī)物。它與發(fā)酵液形成的體系具有氧傳遞速度快、能耗低、氣泡生成少、剪切力小等特點(diǎn)。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，在利用野油菜黃單胞菌產(chǎn)黃膠原(參見文獻(xiàn)：楊秋艷等，“氧載體(正己烷)對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響”，[J].食品科技，2009，34(4)：218-221)、利用大腸桿菌產(chǎn)天冬酰胺酶(參見文獻(xiàn)：劉紅、魏東芝，“氧載體對(duì)L2天冬酰胺酶發(fā)酵過程影響的研究”，[J].生物工程學(xué)報(bào)，1998，14(3)：298-302)、用土曲霉產(chǎn)衣康酸(參見文獻(xiàn)：賈士儒等，“氧載體發(fā)酵體系的氧傳遞特性及提高衣康酸產(chǎn)酸能力的研究”，工業(yè)微生物，1997，27(4)：9-13)等發(fā)酵過程中補(bǔ)加液態(tài)烷烴、四氟化碳等載氧體，取得了較好的效果。

而現(xiàn)有的有關(guān)利普司他汀發(fā)酵工藝方面的專利文獻(xiàn)(例如EP0803576A2、US20050089978A1)則主要集中在對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化和提取工藝優(yōu)化方面，尚未有在發(fā)酵過程中補(bǔ)加載氧體以提高利普司他汀發(fā)酵液中溶氧濃度的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法。

具體而言，本發(fā)明提供：

(1)一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，該方法包括：

1)將生產(chǎn)利普司他汀的毒三素鏈霉菌(Streptomyces?toxytricini)在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；以及

2)在步驟1)中的所述發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行16-120小時(shí)的時(shí)候，將無菌的載氧體補(bǔ)加到發(fā)酵液中，

其中，所述載氧體包含血紅蛋白、甲基硅油或四氟化碳。

(2)根據(jù)(1)所述的方法，其中，所述補(bǔ)加的次數(shù)為一次或多于一次。

(3)根據(jù)(1)所述的方法，其中，在所述發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行16-48小時(shí)的時(shí)候，進(jìn)行首次所述補(bǔ)加。

(4)根據(jù)(2)所述的方法，其中，進(jìn)行每次所述補(bǔ)加的前提條件是，所述發(fā)酵液中溶氧低于30％。

(5)根據(jù)(2)-(4)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，進(jìn)行每次所述補(bǔ)加時(shí)，對(duì)于每升所述發(fā)酵液，補(bǔ)加0.01-0.3g所述載氧體。

(6)根據(jù)(5)所述的方法，其中，在所述的步驟2)中，對(duì)于每升所述發(fā)酵液，總共補(bǔ)加不超過1.5g的所述載氧體。

(7)根據(jù)(6)所述的方法，該方法還包括：

3)繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)40-60小時(shí)，然后停止發(fā)酵。

(8)根據(jù)(1)所述的方法，其中，所述載氧體包含四氟化碳。

本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

本發(fā)明提供的方法能夠在發(fā)酵培養(yǎng)毒三素鏈霉菌生產(chǎn)利普司他汀的過程中補(bǔ)加可以提高發(fā)酵液溶氧的物質(zhì)，可提高發(fā)酵過程中的溶解氧，保證菌絲體生長代謝對(duì)氧的需求，進(jìn)而提高發(fā)酵產(chǎn)量20％以上；同時(shí)，載氧體血紅蛋白、甲基硅油和四氟化碳來源廣泛，價(jià)格較低，不存在環(huán)境污染，生產(chǎn)操作簡單，對(duì)設(shè)備要求低，成本較低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。綜上所述，本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀方法能較大幅度降低生產(chǎn)成本，具有工業(yè)化價(jià)值。