[發(fā)明專利]一種3群霍亂弧菌熒光PCR檢測試劑盒及系統(tǒng)鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110196918.4
• 申請日: 2011-07-14
• 公開（公告）號: CN102242216A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅蕓;葉菊蓮;張政;金大智
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種3群霍亂弧菌熒光PCR檢測試劑盒，以及利用該試劑盒進(jìn)行3群霍亂弧菌系統(tǒng)鑒定的方法。

(二)背景技術(shù)

霍亂是由霍亂弧菌引起的一類以腹瀉為主要癥狀的烈性傳染病，是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一，曾在世界上引起多次大流行。霍亂弧菌(Vibrio?cholerae)是人類霍亂的病原體。霍亂弧菌根據(jù)菌體(O)抗原的不同，已被分為200個以上的血清群，其中只有O1和O139群能引起霍亂大流行，其余的血清型廣泛分布于自然界水體中，一般不致病或僅引起散發(fā)性腹瀉病例和腸道感染。

世界衛(wèi)生組織腹瀉控制中心將霍亂弧菌分為3群：O1群霍亂弧菌、非O1群霍亂弧菌、不典型O1群霍亂弧菌。以往認(rèn)為非O1群弧菌不致病或僅引起散發(fā)的輕度腹瀉，但1992年印度河孟加拉國等地暴發(fā)流行的霍亂首次被證實由非O1群弧菌引起。非O1群霍亂弧菌部分血清群可產(chǎn)生霍亂樣腸毒素，從而引起人類腹瀉并時有爆發(fā)流行的報道，因此近年受到細(xì)菌學(xué)專家的廣泛關(guān)注。霍亂弧菌檢測的傳統(tǒng)方法主要有形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、凝結(jié)試驗等，這些檢測的周期長，一般在18～24小時以上，對因環(huán)境或營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的異形菌株(如L型、球型菌株)則不能檢測。一些免疫學(xué)方法盡管速度快，但結(jié)果不穩(wěn)定，而且目前的常規(guī)檢測方法只針對O1群和O139群血清型的霍亂弧菌進(jìn)行檢測，對于非O1、非O139群血清型的菌株均無法進(jìn)行檢測。同時，已經(jīng)有研究闡明了toxR、hlyA等毒力基因可以從霍亂O1群產(chǎn)毒株轉(zhuǎn)移到環(huán)境非O1、O139群菌株，增強(qiáng)了非O1、O139群菌株的毒性，研究表明非O1、非O139群霍亂弧菌比O1、O139群霍亂弧菌更適于在海水產(chǎn)品中更適于生存和繁殖，因此極大地威脅海水產(chǎn)品的食品安全。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是根據(jù)3群霍亂弧菌的蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、氧化酶、粘絲、無鹽胨水等典型生化特征發(fā)明一個快速檢測方法及檢測過程中所用的熒光PCR檢測試劑盒。

本發(fā)明根據(jù)外膜蛋白基因(ompW)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)和溶血素基因(hlyA)設(shè)計引物和TaqMan探針，霍亂弧菌外膜蛋白基因作為鑒定霍亂弧菌的特征性基因，其他兩種基因作為甄別霍亂弧菌攜帶的毒素基因，通過上述三個基因提供一種檢測霍亂弧菌及其相關(guān)毒素基因的熒光檢測方法。通過上述生化反應(yīng)對菌株進(jìn)行初篩，結(jié)果均為陽性的菌株用熒光定量PCR進(jìn)行確認(rèn)，ompW基因陽性的為霍亂弧菌。通過上述生化反應(yīng)及熒光定量PCR可實現(xiàn)對霍亂弧菌及其相關(guān)毒素基因的快速、準(zhǔn)確、特異檢測。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種3群霍亂弧菌熒光PCR檢測試劑盒，主要包括外膜蛋白基因(ompW)特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探針如下：

ompW上游引物：5′-TCCTCAACGCTTCTGTGTGGTAT-3′

ompW下游引物：5′-ATTGATTTCAACATCCGTGGATT-3′

ompW熒光探針：5′-FAM-TGA?AAC?AAC?GGC?AAC?CTA?CAA?AGCAGG-BHQ1-3，其中FAM為熒光報告基團(tuán)，BHQ1為熒光淬滅基團(tuán)。

為達(dá)到定量檢測的效果，所述試劑盒還包括ompW標(biāo)準(zhǔn)品，所述ompW標(biāo)準(zhǔn)品序列如下：cttgac?gactcatggg?gacttgctgc?taacgttggc?tttgattatatgctcaatga?tagctggttc?ctcaacgctt?ctgtgtggta?tgccaatatt?gaaacaacgg?caacctacaaagcaggtgca?gatgccaaat?ccacggatgt?tgaaatcaat?ccttgggtat?ttatgatcgc?gggtgg。

為進(jìn)一步檢測霍亂弧菌的毒力，所述試劑盒還包括毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)特異性引物和熒光探針以及溶血素基因(hlyA)特異性引物和熒光探針，所述特異性引物和熒光探針如下：

toxR上游引物：5′-GATTCGACAAAGTCCCCACAA-3′

toxR下游引物：5′-TCGGGCGATCAATTGGTAA-3′

toxR熒光探針：5′-HEX-CGT?CAA?AAC?GGT?TCC?GAA?ACG?CG-BHQ1-3′

hlyA上游引物：5′-AGTGGTCAACCGATGCGATT-3′

hlyA下游引物：5′-TTCAGGATCTGCGCTTTATTGTT-3′