[發明專利]一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法

有效

• 申請號: 201110195718.7
• 申請日: 2011-07-13
• 公開（公告）號: CN102258059A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 呂玉成;薛明政;史蘭東
• 申請（專利權）人: 山東玉成生化農藥有限公司
• 主分類號: A01N63/02
• 分類號: A01N63/02;A01P1/00;C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 李江

技術領域

本發明涉及一種抗煙草青枯病的菌劑，具體地說是一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，屬于生物菌劑領域。

背景技術

煙草青枯病是一種細菌病害，在各煙區普遍發生，常常暴發流行，造成毀滅性損失。該病病源：青枯雷爾氏菌和青枯假單胞桿菌，能侵染30余科的200多種植物。對煙草、番茄、花生及馬鈴薯侵害更明顯。常與黑脛病等根莖病害混合發生，危害更嚴重。

枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）廣泛存在于自然界中，該菌作為植物病害生物防治細菌之一，由于該菌能產生耐熱的芽孢，即易于生產、菌劑的加工，又易于存活、定植和繁殖。批量生產工藝簡單，成本也較低，施用方便，儲存期長，而且其菌劑的穩定性與化學農藥的相容性、以及與不同植物不同年份防治效果的一致性方面均優于不產生芽孢的細菌和真菌，是一種較理想的生防微生物。

發明內容

本發明的目的在于，提供了一種對煙草青枯病害具有高效、無毒、安全以及對環境無污染的微生物枯草芽孢菌劑的制備方法。

在芽孢桿菌發酵后期，通過合理調節發酵生產參數的控制、添加調配功能性的有機氮源，促使芽孢桿菌在后期代謝性生長，產生堿性蛋白的代謝，再通過調整發酵工藝控制參數，促使菌體形成芽孢，當菌體芽孢形成率達到55～65%以上時，不再做發酵液pH的調整，讓其自然變化，當發酵液菌體形成芽孢率在85%以上，最終發酵液pH值自然提高至7.7～8.0時，發酵結束。

本發明的技術方案：

一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括以下步驟：

1、菌種活化：對保藏的枯草芽孢桿菌進行活化培養至芽孢脫落；

活化所用的培養基配方為：牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至1000ml；用于枯草芽孢桿菌的活化及活菌數的測定；

2、搖床擴大培養：將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養基中進行搖床擴大培養。初始pH值為7.0～7.2，培養溫度為30℃，搖床轉速為200rpm，至15～20％的芽孢脫落為止；

所用的液體培養基的配方為：玉米粉6.5g，葡萄糖?2.5g，豆餅粉10.1g，魚粉2.5g，CaCO₃?3.5g，(NH₄)₂SO_4?0.5g，K₂HPO_4?0.15g，MgSO₄·7H₂O?0.1g，MnSO₄·H₂O?0.1g，水定容至500ml。

3、種子罐擴大培養：在無菌操作下，將搖床擴大培養得到的菌液接入到含有種子罐培養基的種子罐內，初期通風比1︰0．25，即一立方發酵液一分鐘通氣量為0.25立方，后期通風比1︰1；同時，控制發酵液的pH值為6.9～7.3，溫度為32℃，發酵罐的攪拌轉速為80～220?rpm；至芽孢桿菌進入對數生長期的后期；

及時進行對種子發酵液的檢查和對芽孢桿菌生長狀況的觀測；菌種接種后12h菌體生長處于指數生長中期；當芽孢桿菌進入對數生長期的后期，進行無菌轉種接入發酵罐，進行發酵；

所用的種子罐培養基配方為：玉米粉12.98g，葡萄糖5g，豆餅粉20.1g，魚粉5g，CaCO₃?6.90g，(NH₄)₂SO₄?1g，K₂HPO₄?0.3g，MgSO₄·7H₂O?0.2g，MnSO₄·H₂O?0.2g，水定容至1000ml。

4、發酵罐發酵

將培養至指數生長期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉入裝有發酵罐培養基的發酵罐，罐裝量為發酵罐容積的70％，進行發酵罐的前期培養和后期培養；

（1）發酵罐前期培養方法為：對接入種子液的發酵罐，溫度28～32℃，pH6.9～7.3，通風量1︰0．25～1.1，攪拌轉速150～180?rpm；保持發酵液總糖含量0.35～0.6%、總氮含量30～45ng/ml，培養至芽孢形成率55～65%，進入發酵后期；

發酵罐前期培養期間要及時檢查和觀測菌種生長狀況，隨著菌種的增長，菌體密度的增加，逐漸加大通風量，增加溶氧，提高轉速，以配合菌種生長的需氧量，同時，通過與發酵罐相連的無菌補液罐來維持發酵液pH值；