[發(fā)明專利]一種檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的方法及試劑盒

無效

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• 申請日: 2011-07-11
• 公開（公告）號: CN102286616A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設計）人: 李瑤;張舒林;彭勁甫;吳海;溫子祿
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥體外診斷試劑技術領域，具體涉及一種快速檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因(katG?315位與inhA?-15位)突變的方法及試劑盒。

背景技術

近年來，耐藥結核病問題日趨嚴重，已成為結核病控制的難題之一。由于抗結核藥物的不規(guī)范治療,?患者體內的結核桿菌對多種抗結核藥物發(fā)生耐藥,?從而形成耐多藥結核病,?這是結核病疫情重新上升的最主要原因之一。因此，結核病的快速診斷和最佳個體化治療方案的建立是結核控制中的重要挑戰(zhàn)之一。

由于結核分枝桿菌生長緩慢，如今廣泛應用的耐藥測定方法均是建立在菌株的基礎上，雖然使用了新的液體培養(yǎng)基，但仍然耗時較長，推遲了獲得菌株敏感型的時間。在現階段，我國各醫(yī)院廣泛采用痰培養(yǎng)加藥物敏感性實驗來檢測結核桿菌的耐藥性，即先培養(yǎng)出結核桿菌，再給予抗結核藥物，并觀察藥物抑菌效果。該法的檢測結果可靠，但最大不足之處是培養(yǎng)條件要求高，結核桿菌生長緩慢，往往需要6-8周；同時痰培養(yǎng)檢出率低，僅為30%，故藥敏試驗的檢出率也僅有30%左右，不能滿足臨床檢測需要。因此，開發(fā)一種快速準確診斷耐多要結核病的檢測方法，對于早期發(fā)現、阻斷耐藥結核病的傳播，規(guī)范指導用藥，提高耐藥結核病的治愈率具有非常重要的意義。近年來報道了許多檢測結核耐藥突變的分子生物學方法，然而這些方法往往需要大量的人力和長勢良好的培養(yǎng)基。臨床診斷需要一種簡單、快速、重復性好的方法對一系列與結核耐藥相關的基因突變進行檢測。Real-time?PCR技術結合了PCR的靈敏性和DNA雜交的特異性等優(yōu)點，具有操作簡單，結果判斷直觀以及無污染等特點，在臨床診斷中已被廣泛用于多種微生物病原體DNA的檢測。因此，本發(fā)明將Real-time?PCR(Taqman/MGB水解探針)技術成功引入到結核分枝桿菌耐藥基因檢測的領域中。聚合酶鏈式反應（polymerase?chain?reaction，PCR）技術發(fā)明至今已20年，在此期間得到了不斷發(fā)展，近年來出現的實時熒光定量PCR(Real-time?quantitative?PCR)技術實現了PCR從定性到定量的飛躍。它以特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點成為了分子生物學研究中重要工具。目前real-time?PCR所使用的熒光化學方法主要有5大類，分別是：DNA結合染料，水解探針（Taqman和MGB探針），分子信標（molecular?beacon）,熒光標記引物，雜交探針。他們又可分為擴增序列特異和非特異檢測兩類。擴增序列非特異性檢測方法的基礎是DNA結合的熒光分子，如SYBR?Green?I等熒光染料。SYBR?Green?I熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，可發(fā)射熒光信號。熒光染料的優(yōu)勢在于能檢測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。但正是由于熒光染料能和任何dsDNA結合，因此它也能與非特異的dsDNA(例如引物二聚體)結合，使實驗容易產生假陽性信號。擴增序列特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光基團的基因特異性寡核苷酸探針來檢測擴增產物。它又可分為直接法和間接法。間接法就是利用水解探針的策略。目前在real-time?PCR中最廣泛使用的Taqman系統(tǒng)就是運用這個原理。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性熒光探針。該探針是一段寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。當探針完整時，檢測不到該探針5’端熒光基團發(fā)出的熒光。但在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結核。在引物的介導下，沿模板向前延伸至探針結合出，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針5’熒光基團從探針上切割下來，游離于體系中，從而脫離3’端熒光淬滅基團的屏蔽而發(fā)出熒光信號，而且是每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子成功發(fā)光，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成的完全同步。為取得較高的分辨率和優(yōu)秀的信噪比，還可以選用Taqman?MGB?探針。MGB探針其顯著優(yōu)點是長度短，信噪比好，為非熒光淬滅基團，性能穩(wěn)定而熒光干擾小；分辨率高，可以區(qū)分一個堿基。一個堿基不同即可引起Tm值的大幅降低如20度，錯配既可為陰性結果，廣泛應用于SNP分析。而常規(guī)的Taqman探針具有一定容錯能力，1-3個堿基錯配有可能不影響檢測，Tm值相差不大，結果仍為陽性。