[發明專利]一種檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的方法及試劑盒

無效

• 申請號: 201110192114.7
• 申請日: 2011-07-11
• 公開（公告）號: CN102286616A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 李瑤;張舒林;彭勁甫;吳海;溫子祿
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

1.一種結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的檢測方法，其特征在于具體步驟包括：

通過擴增反應，擴增結核分子桿菌基因組序列，其中，所述基因組的區域中的突變引起了結核分枝桿菌的異煙肼耐藥；

所述擴增反應的擴增體系包括2條標記的寡核苷酸探針，2對擴增引物和一個熱穩定的DNA聚合酶；

所述標記的寡核苷酸探針與擴增的基因組序列雜交，產生可判讀的擴增曲線圖；

所述標記的寡核苷酸探針與靶核苷酸序列雜交區至少包含一個異煙肼基因突變位點，而且所述標記的寡核苷酸探針與野生型靶核苷酸互補；

所述寡核苷酸探針是雙標記探針，包括一個報告標記熒光基團和一個淬滅標記基團。

2.根據權利要求1所述的結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的檢測方法，其特征在于所述基因組區域選自與耐異煙肼相關的katG基因、inhA基因啟動子區；

所述基因組區域中的突變包括：katG基因的315位點，inhA基因的-15位點。

3.根據權利要求1或2所述的結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的檢測方法，其特征在于所述2條寡核苷酸探針為SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示，所述2對擴增引物為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2，SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示。

4.根據權利要求1或2或3所述的結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的檢測方法，其特征在于所述DNA聚合酶是具有5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。

5.根據權利要求1—4之一所述的結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的檢測方法，其特征在于所述報告標記是熒光基團，它標記在寡核苷酸探針5’末端，種類是FAM、TET、JOE、HEX、CY3、ROX、CY5中任一種；所述淬滅標記是熒光或者非熒光基團，它標記在探針3’末端，種類是TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB中任一種。

6.一種檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的探針，其特征在于此探針由13~19個核苷酸組成，為SEQ?ID?NO.5?和SEQ?ID?NO.6所示；上述探針包括一個標記在5’端的報告標記熒光基團和一個標記在3’端的淬滅標記基團；在PCR反應退火階段，此探針與結核分子桿菌的katG?315位區域以及inhA啟動子-15位區域雜交，然后在帶5’->3’外切酶活性的DNA聚合酶催化引物延伸過程中，被DNA聚合酶切離，令報告標記游離出來，發出熒光。

7.一個從樣本中檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的試劑盒，其特征在于包括：至少兩對擴增引物和至少兩條標記的寡核苷酸探針，一種熱穩定并且具有5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶，以及PCR擴增所需要的其他常用組分；其中所述兩對擴增引物為SEQ?ID?NO.1?和SEQ?ID?NO.2，SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示；所述兩條探針為SEQ?ID?NO.5?和SEQ?ID?NO.6所示。