[發明專利]人體iPS細胞未分化擴增的水凝膠培養支架的制備方法

有效

• 申請號: 201110191645.4
• 申請日: 2011-07-08
• 公開（公告）號: CN102382797A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 陳詠梅;劉健康;劉振齊
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C08F220/06;C08F220/28;C08F2/48;C08F220/14;C08F212/14;C08F226/10
• 代理公司: 西安智大知識產權代理事務所 61215
• 代理人: 弋才富

技術領域

本發明屬于生物材料技術領域，具體涉及一種人體iPS細胞未分化擴增的水凝膠培養支架的制備方法。

背景技術

干細胞是人體及其各種組織細胞的初始來源。它的研究受到了全世界政府和科學界的極大重視并已成為世界科學的熱點研究領域之一。以干細胞為基礎的專利權和專有技術在生命科學、藥學、組織工程、基礎醫學及醫療應用領域中的潛在價值不可估量。

多潛能干細胞(pluripotent?stem?cells)是一類既具有自我更新又具有全能性的干細胞。自我更新指多潛能干細胞能夠在體外進行無限期的培養和傳代，通過細胞分裂擴增出與自身相同的高度未分化細胞，維持自己的全能性而不會隨著細胞的分裂而喪失。全能性指在一定的條件下，多潛能干細胞可以進一步分化成各種成體細胞，進而構成機體的各種組織和器官。目前，最受關注的多潛能干細胞是(embryonic?stem，ES)細胞和(induced?ploiPS)細胞。ES細胞是前胚胎囊胚期的內細胞團細胞在體外特定培養條件下得到的特殊細胞，理論上具有發育和分化成為機體內幾乎所有組織細胞類型的潛能，故又稱為“萬能細胞”。典型的人體iPS細胞是采用體外基因轉染技術，通過將一組4個基因(Oct3/4，Sox2，c-Myc，and?Klf4)轉入皮膚成纖維細胞，使其重新編程逆轉到細胞分化前的狀態，具有與ES細胞類似的形態和功能的細胞。iPS細胞具有和ES細胞類似的功能，卻繞開了ES細胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多障礙，因此在醫療領域的應用前景非常廣闊。iPS細胞作為生命科學、藥學、組織工程、基礎醫學及醫療應用領域研究中最有前景的種子細胞，將從根本上解決供體細胞來源不足的問題。體外培養人體iPS細胞的基本原則是：最大限度地抑制分化，維持其自我更新性能，同時促進其快速增殖及維持其正常的二倍體核型。iPS細胞只有保持未分化性能才具有全能性，所以涉及iPS細胞的所有研究都首先要以未分化iPS細胞作為研究起點的種子細胞，因此，獲取該種子細胞成為人體多潛能干細胞研究的關鍵。

由于iPS細胞的建系效率只有0.02％，所以需要大量擴增。目前，人體iPS細胞培養法的材料通過制備滋養層結構，該滋養層結構來進行培養，在該方法中先將滋養層細胞在組織培養用聚苯乙烯板(tissue-culture?polystyrene，TCPS)表面貼壁單層培養擴增之后，再將多潛能性干細胞播種到滋養層細胞(目前大多使用受射線照射或絲裂霉素處理后胚胎鼠源成纖維細胞作為滋養細胞)之上培養的方法，該方法中人體iPS細胞培養依賴滋養層細胞。該方法存在以下問題：(1)滋養層細胞的問題。小鼠胚胎成纖維細胞生命期有限，不能在體外長期傳代，且體外傳代次數增多，其產生抑制分化因子和促進增殖因子的能力會減弱甚至喪失，在第3～5代時使用最好，所以只能過一段時間后解剖孕鼠提取，這增大了體外培養的工作量；(2)細胞分離問題。在滋養層細胞上擴增培養的人體iPS細胞克隆(cell?colony，指圓形或橢圓形的細胞的聚集體，)需要在顯微鏡下用特殊的工具逐個挑選，操作難度大。因此，滋養層培養法不但存在操作繁瑣復雜、耗費人力物力、效率低以及難以大量獲取的缺點，而且還存在著異種動物交叉感染的危險性。

為了克服滋養層細胞帶來的問題，開發了以基質膠(Matrigel)作為人體iPS細胞培養支架的制備方法，該方法制備的培養支架，由于基質膠是一種天然水凝膠，主要成分包括層黏連蛋白和膠原IV，同時含有TGF-β成纖維細胞生長因子，組織纖維酶原活化因子以及其它在Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)腫瘤中自然表達的生長因子。在室溫下，Matrigel可自動聚集產生類似于哺乳動物細胞基底膜的生物活性基質材料。雖然使用方便，但其不但成分復雜且含有未知蛋白質，依然存在異種動物交叉感染的危險性。因此，需要建立一套能夠達到安全簡便且高效穩定的人體iPS細胞未分化擴增的培養支架的制備方法。

發明內容

為了克服上述現有技術存在的不足，本發明的目的在于提供一種人體iPS細胞未分化擴增的水凝膠培養支架的制備方法，由此制備方法制備出來的水凝膠細胞支架既不修飾任何從動物體內抽提的蛋白質，也不涉及任何滋養層細胞的條件下，以合成高分子水凝膠為細胞培養支架，由于具有合成高分子水凝膠的化學結構明確、物理化學性能穩定且易于調控、無異物感染且易于滅菌且廉價的優勢，是安全培養人體多潛能干細胞的理想生物材料，由此能建立安全簡便擴增未分化人體iPS細胞的軟材料培養體系。

為了達到上述目的，本發明所采用的技術方案是：