[發明專利]人體iPS細胞未分化擴增的水凝膠培養支架的制備方法

有效

• 申請號: 201110191645.4
• 申請日: 2011-07-08
• 公開（公告）號: CN102382797A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 陳詠梅;劉健康;劉振齊
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C08F220/06;C08F220/28;C08F2/48;C08F220/14;C08F212/14;C08F226/10
• 代理公司: 西安智大知識產權代理事務所 61215
• 代理人: 弋才富

1.一種人體iPS細胞未分化擴增的水凝膠培養支架的制備方法，其特征在于，步驟如下：

步驟1：首先制備電解質高分子單體溶液，即將電解質高分子單體和溶劑按質量比范圍1∶50～1∶100混合而得電解質高分子單體溶液，溶劑為去離子水或pH值為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖溶液，電解質高分子單體包括帶負電荷的丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸鈉、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、帶正電荷的丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨或者丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨；

步驟2：制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質量比范圍1∶100～1∶200混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為去離子水或pH值為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括甲基丙烯酸羥乙脂、甲基丙烯酸甲酯、N-乙烯基吡喏烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N，N′二甲基丙烯酰胺；

步驟3：制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1∶0.5～1∶1.0混合均勻后，加入質量濃度為1～10％的N，N′-亞甲基雙丙酰胺交聯劑和質量濃度為0.1％的2-氧代-1，5-戊二酸引發劑，其中電解質高分子單體和所述的N，N′-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1∶0.1～1∶0.5，而中性高分子單體和所述的N，N′-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1∶0.2～1∶0.5，再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮氣脫氧30分鐘后加入板狀合成模具中，再用365nm的紫外燈對板狀合成模具內氮氣脫氧后的混合溶液在室溫下照射6小時后，再單體聚合為高分子水凝膠；

步驟4：進行高分子水凝膠pH值和離子強度的調節，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應單體、交聯劑及引發劑，然后將高分子水凝膠用4-(-2-hydroxyethyl)-piperazine-1-ethansulfonic?acid的HEPES緩沖溶液浸泡，該HEPES緩沖溶液還包括5×10^-3M的HEPES、1.55×10^-2M的NaHCO₃、0.14M的NaCl以及2.5×10^-3g/l的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強度I為0.15M以及pH值為7.4，并且每經過12小時更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達到溶脹平衡，此時高分子水凝膠的離子強度和pH值與細胞培養液一致；

步驟5：將達到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為1.5mm-2mm的圓柱狀，在溫度為120℃條件下，經過20分鐘高壓滅菌之后轉移至培養板的孔中，這樣培養板和其上的高分子水凝膠就形成了人體iPS細胞未分化擴增的水凝膠培養支架。

2.根據權利要求1所述的人體iPS細胞未分化擴增的水凝膠培養支架的制備方法，其特征在于：板狀合成模具是由玻璃板圍成的框架結構構成的容器，且該框架結構內設置有硅膠墊，其長寬高尺寸分別為10cm、10cm以及0.1cm。