[發明專利]環介導等溫擴增超級細菌NDM-1基因的引物及檢測超級細菌NDM-1基因的試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201110190462.0
• 申請日: 2011-07-08
• 公開（公告）號: CN102242210A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 齊靜;劉玉慶;杜以軍;白華;駱延波;朱曉玲;胡明;胡新新;張秀美
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

技術領域????

本發明屬于細菌基因檢測技術領域，特別涉及環介導等溫擴增超級細菌NDM-1基因的引物，還涉及一種用環介導等溫擴增方法檢測超級細菌NDM-1基因的試劑盒，還涉及用環介導等溫擴增方法檢測超級細菌NDM-1基因的檢測方法。

背景技術

超級細菌，是一類耐藥細菌的統稱，包括耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌MRSA、耐萬古霉素的糞腸球菌VRE、碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌，碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌，碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌，碳青霉烯耐藥其它腸桿菌科細菌等。

最近引起世界關注的超級病菌NDM-1是一種新型的超級細菌(全稱為New?Delhi?metallo-β-lactamase-1，即新德里金屬β-內酰胺酶1)可以抵御幾乎所有抗生素，NDM-1編碼一種新的耐藥酶，稱為NDM-1金屬β-內酰胺酶。含NDM-1基因的腸桿菌科細菌已威脅人類的健康，并對各種抗生素不敏感，給臨床治療帶來了巨大挑戰。

對于攜帶NDM-1基因的超級細菌的實驗室診斷主要基于PCR技術進行基因確證。如申請號為201010554690.7，名稱為“一種抗生素耐藥NDM-1基因的熒光檢測試劑盒及檢測方法”的中國發明專利申請，設計了一個熒光探針引物，降低了PCR擴增的假陽性率，但假陽性仍然存在，并且檢測成本高，操作比較復雜，檢測時間長，一般需要2-3小時，都影響到臨床攜帶NDM-1基因的超級細菌的檢測結果。

環介導等溫擴增方法（LAMP）是近幾年新興的一種基因擴增方法，對儀器設備要求不高，只需要恒溫水浴鍋或金屬浴即可，成本低，且臨床上容易做到，檢測時間較短，不超過1個小時，為快速、準確診斷基因的一種新方法。環介導等溫擴增方法已經廣泛應用于檢測細菌領域，并有很多相關專利獲得授權。目前國內外均未見使用LAMP方法檢測新型超級細菌NDM-1基因的報道。

發明內容???

為了解決PCR擴增易出現假陽性、檢測成本高、操作復雜、檢測時間長的問題，填補使用LAMP檢測新型超級細菌NDM-1基因的空白，本發明提供了用環介導等溫擴增超級細菌NDM-1基因的引物。本發明建立了一種新型超級細菌NDM-1基因LAMP檢測方法，根據NDM-1基因保守區的6段序列設計了一對特異性內引物，一對特異性外引物和一對環引物。

本發明還提供了檢測超級細菌NDM-1基因的試劑盒。

本發明還提供了檢測超級細菌NDM-1基因的檢測方法。

本發明是通過以下措施實現的：

一種環介導等溫擴增超級細菌NDM-1基因的引物，由一對外引物，一對內引物和一對環引物組成，其核苷酸序列分別如下：

外引物F3：5’-GGCCACACCAGTGACAAT-3’，

外引物B3：5’-GCGGAATGGTCATCACGAT-3’，

內引物FIP：5’-ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3’，

內引物BIP：5’-CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3’，

環引物LF：5’-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3’，

環引物LB：5’-ACACTGAGCACTACGCCG-3’，

其中，外引物與內引物的摩爾比為1:8，外引物與環引物的摩爾比為1:4。

一種檢測超級細菌NDM-1基因的試劑盒，包括若干個裝有反應液的LAMP反應管，?

其中，每25?μL反應液中含有：12.5?μL?2×等溫反應緩沖液、1.0?μL?Bst?DNA聚合酶、40?pmol內引物FIP、40?pmol內引物BIP、5?pmol外引物F3、5?pmol外引物B3、20?pmol環引物LF、20?pmol環引物LB，余量為滅菌雙蒸水；

其中，Bst?DNA聚合酶的活性單位為8U/μL；

2×等溫反應緩沖液中含有40?mM?pH為8.8的Tris-HCl、20?mM?KCl、16?mM?MgSO₄、20?mM?（NH4）₂SO₄、0.2wt%?Tween20、1.6?M?甜菜堿、2.8?mM?dNTP。