[發明專利]環介導等溫擴增超級細菌NDM-1基因的引物及檢測超級細菌NDM-1基因的試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201110190462.0
• 申請日: 2011-07-08
• 公開（公告）號: CN102242210A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 齊靜;劉玉慶;杜以軍;白華;駱延波;朱曉玲;胡明;胡新新;張秀美
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種環介導等溫擴增超級細菌NDM-1基因的引物，其特征是由一對外引物，一對內引物和一對環引物組成，其核苷酸序列分別如下：

外引物F3：5’-GGCCACACCAGTGACAAT-3’，

外引物B3：5’-GCGGAATGGTCATCACGAT-3’，

內引物FIP：5’-ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3’，

內引物BIP：5’-CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3’，

環引物LF：5’-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3’，

環引物LB：5’-ACACTGAGCACTACGCCG-3’，

其中，外引物與內引物的摩爾比為1:8，外引物與環引物的摩爾比為1:4。

2.一種檢測超級細菌NDM-1基因的試劑盒，其特征是包括若干個裝有反應液的LAMP反應管，?

其中，每25?μL反應液中含有：12.5?μL?2×等溫反應緩沖液、1.0?μL?Bst?DNA聚合酶、40?pmol內引物FIP、40?pmol內引物BIP、5?pmol外引物F3、5?pmol外引物B3、20?pmol環引物LF、20?pmol環引物LB，余量為滅菌雙蒸水；

其中，Bst?DNA聚合酶的活性單位為8U/μL；

2×等溫反應緩沖液中含有40?mM??pH為8.8的Tris-HCl、20?mM?KCl、16?mM?MgSO₄、20?mM?（NH4）₂SO₄、0.2wt%?Tween20、1.6?M?甜菜堿、2.8?mM?dNTP。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于還包括1?μL鈣黃綠素。

4.一種檢測超級細菌NDM-1基因的檢測方法，其特征是包括以下步驟：

（1）提取待檢細菌基因組總DNA；?

（2）使用權利要求2或3所述的試劑盒進行檢測，具體操作為：將待檢細菌基因組DNA加入LAMP反應管的反應液內，混勻，同時設陰性對照和陽性對照，陽性對照中加入反應液內的為含有NDM-1基因的基因組DNA，陰性對照中加入反應液內的為滅菌雙蒸水，將LAMP反應管置水浴鍋中進行擴增，擴增條件為：65℃水浴恒溫反應35?min。

5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征是步驟（2）中待檢細菌基因組DNA為含DNA的濃度為0.003-300?ng/μL的DNA溶液。

6.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征是LAMP反應管中出現白色沉淀為陽性結果，不出現白色沉淀為陰性結果。

7.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征是在擴增反應前的反應管中加入1?μL鈣黃綠素，反應結束后擴增產物變為綠色的為陽性結果，橙色的是陰性結果。