[發明專利]白血病細胞內融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法

有效

• 申請號: 201110189985.3
• 申請日: 2011-07-07
• 公開（公告）號: CN102353793A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 蘭文軍;王海燕;王哲理;閆磊
• 申請（專利權）人: 山東輕工業學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 苗奎

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種白血病細胞內融合蛋白的檢測方法。

背景技術

流式液相陣列(又稱流式微球陣列)是能保證信息質量和提供相對高通量的分子探測平臺，與其技術原理相同的液相芯片技術是美國FDA2001年批準的首個臨床型陣列分析技術。流式液相陣列中，微球錨定的捕獲分子(抗體或核酸探針)捕獲靶點分子，熒光標記的報道分子(抗體或核酸探針)報道靶點分子，一種或幾種不同濃度熒光編碼的微球組建陣列即可進行多參數并行分析。陣列解碼常用生物醫學工程儀器流式細胞儀或專用液相芯片儀。流式液相陣列具有靈敏度高、特異性強、數據圖像化及多任務定量的顯著優點。

流式液相陣列已廣泛應用于分子診斷、藥物發現、檢驗檢疫、免疫技術和細胞學等領域。以熒光編碼微球和核酸探針構建的流式液相陣列可以實施白血病診斷和微小殘留病監測；基于流式液相陣列的分子結合分析能夠同步篩選配基競爭性和ATP競爭性受體酪氨酸激酶拮抗劑，“敲除”藥物抵抗先導物，避免放射法污染，可以快速、準確、有效地發現抗腫瘤先導藥物；此外探測細胞信號通路傳導的流式液相陣列也見諸報道。相比其它生物分子檢測手段，基于熒光編碼微球的流式液相陣列和液相芯片具有下述突出優點：(1)相對高通量。可以并行檢測多個參數；(2)靈敏度高。檢測下限約為10pg/mL；(3)微量檢測。所需樣本少，特別是臨床檢驗只需幾微升血液樣品，即可快速完成多個并行臨床參數檢測。

白血病存在因染色體畸變而產生的融合基因和融合蛋白，異常染色體、融合基因和融合蛋白分別是白血病細胞生物學和分子生物學特異性標志。目前白血病細胞內融合蛋白表達水平常用的檢測方法為逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse?Transcription-Polymerase?Chain?Reaction，RT-PCR)、定量聚合酶鏈反應(quantitative?Polymerase?Chain?Reaction，Q-PCR)、細胞遺傳學、熒光原位雜交(fluorescence?in?situ?hybridization，FISH)和單群微球流式分析。研究表明，RT-PCR技術簡易，但檢測的是mRNA逆轉錄cDNA拷貝，易受反應條件影響，產生假陰性或假陽性結果；Q-PCR檢測敏感性超過10^-4，達到10^-5分子水平緩解標準，但只有管家基因mRNA拷貝數高于2.5x10⁵，結果才有效；染色體核型分析數目少，定量困難；非流式FISH技術3％左右的假陽性率過高，不適用于白血病細胞內融合蛋白表達檢測；白血病細胞內融合蛋白的單群微球流式分析方法變異系數大。

發明內容

針對現有檢測方法的不足，本發明提供了一種白血病細胞內融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，可以快速、準確地檢測白血病細胞內融合蛋白含量。

術語說明：

FITC：異硫氰酸熒光素(fluorescein?isothiocyanate，FITC)；

Alexa?Fluor?488熒光：一種熒光染料的商品名稱，本領域公知產品；

Sulfo-NHS：N一羥基硫代琥珀酰亞胺；

EDC：碳二亞胺；

MES：2-(N-嗎啉代)乙磺酸，2-(N-Morpholino)ethanesulfonic?acid?hydrate，簡稱MES

PBS：磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered?saline，PBS)；

PE：藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)；

PBS-2％BSA溶液：含2％牛血清白蛋白(Bovine?serum?albumin，BSA)的磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered?saline，PBS)；

AEBSF：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽，4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl?fluoride?hydrochloride，簡稱AEBSF；

well_a：a孔；

well_b：b孔；

well_c：c孔；

HBSS’s液：Hank’s平衡鹽溶液，Hank’s?balanced?salt?solution，簡稱HBSS’s液。

本發明的技術方案如下：