[發明專利]白血病細胞內融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法

有效

• 申請號: 201110189985.3
• 申請日: 2011-07-07
• 公開（公告）號: CN102353793A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 蘭文軍;王海燕;王哲理;閆磊
• 申請（專利權）人: 山東輕工業學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 苗奎

1.白血病細胞內融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，包括兩種濃度FITC或兩種濃度Alexa?Fluor?488熒光標記的微球、融合蛋白捕獲抗體、融合蛋白報道抗體、同型對照抗體、PE熒光標記的二抗、緩沖液和流式細胞儀檢測，其特點在于以包被融合蛋白捕獲抗體的一種濃度的FITC或Alexa?Fluor?488熒光標記的微球₁、包被同型對照抗體的另一種濃度的FITC或Alexa?Fluor?488熒光標記的微球₂組建檢測白血病細胞內融合蛋白的二元流式液相陣列，流式細胞儀檢測陣列所得微球₁的PE熒光強度與微球₂的PE熒光強度的二者比值為融合蛋白表達值。

2.如權利要求1所述的白血病細胞內融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，包括步驟如下：

(1)利用現有技術抽提白血病細胞內融合蛋白；

(2)二元流式液相陣列的組建：

10000～100000個一種濃度的FITC或Alexa?Fluor?488熒光標記的微球₁加入到96孔微孔濾膜板well_a中，10000～100000個另一種濃度的FITC或Alexa?Fluor?488熒光標記的微球₂加入到96孔微孔濾膜板well_b中，200μL?MES緩沖液(pH?6.0)洗滌微球₁和微球₂各2次，真空抽濾收集微球；含微球的well_a和well_b孔中再分別加入含0.0001～0.01g?Sulfo-NHS和0.0001～0.01g?EDC的200μLMES緩沖液(pH?6.0)，混勻、室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球₁、微球₂分別用200μL?PBS緩沖液(pH?7.2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球₁的well_a孔中加入1～50μg融合蛋白捕獲抗體，含微球₂的well_b孔中加入1～50μg同型對照抗體，well_a和well_b孔再分別加入PBS緩沖液(pH7.2)補充體積至200μL并混勻，避光、4℃孵育2小時；得包被融合蛋白捕獲抗體的微球₁和包被同型對照抗體的微球₂；

(3)白血病細胞內融合蛋白的二元流式液相陣列檢測，選自下列方案之一：

方案1：將步驟(1)制備的0.5～50μL白血病細胞內融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well_c孔中，再將步驟(2)制備的包被抗體的微球₁與微球₂各1000～10000個混合并加入到well_c孔中，加入PBS-2％BSA溶液補足體積至150μL，混勻、室溫、避光孵育1小時；將所得微球洗滌2次并重懸于100μL的PBS-2％BSA溶液中，再加入0.1～10μg融合蛋白報道抗體，混勻、避光室溫孵育1小時；將所得微球洗滌2次并重懸于100μL的PBS-2％BSA溶液中，加入0.1～10μg?PE熒光標記的二抗，混勻、避光室溫孵育30分鐘；將所得微球洗滌2次并重懸于100μL鞘液中，用流式細胞儀以FITC或Alexa?Fluor?488?versus?PE點圖檢測微球₁和微球₂PE熒光強度；

方案2：將步驟(1)制備的0.5～50μL白血病細胞內融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well_c孔中，再將步驟(2)制備的包被抗體的微球₁與微球₂各1000～10000個混合并加入到well_c孔中，加入0.1～10μg?PE熒光標記的融合蛋白報道抗體，加入PBS-2％BSA溶液補足體積至150μL，混勻、室溫、避光孵育2小時；將所得微球洗滌2次并重懸于100μL鞘液中，用流式細胞儀以FITC或Alexa?Fluor?488?vers?PE點圖檢測微球₁和微球₂PE熒光強度；

(4)按以下公式計算得白血病細胞內融合蛋白定量數據：

白血病細胞內融合蛋白表達值＝微球₁的PE熒光強度÷微球₂的PE熒光強度，或微球₂的PE熒光強度÷微球₁的PE熒光強度。