[發明專利]一種牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201110189165.4
• 申請日: 2011-07-07
• 公開（公告）號: CN102367472A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 馬鶯;徐偉麗;李啟明;仇麗亞;汪家琦
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，是一種適用于牛奶或奶粉中的植物源摻加物的PCR擴增檢測方法。

背景技術

牛奶營養豐富，蛋白含量高質量優，受到消費者的喜愛。奶粉是牛奶的干制品，在乳制品中擁有重要地位。但是現在市場競爭激烈，部分商販為謀取利益往往摻假，在牛奶及奶制品中摻加植物源摻加物，包括豆漿、豆粉、大豆分離蛋白等。對牛奶中植物成分檢測的傳統的化學方法已經有研究，但是由于這些方法存在檢測對象單一、靈敏度低、易受外源因素干擾等缺點，無法準確、快速、高通量的進行區分鑒別。國標法對蛋白質檢測則設備復雜，操作較繁瑣，費用較高，耗時較長。

發明內容

本發明是為解決對牛奶或奶粉中植物源成分檢測的化學方法存在靈敏度低，易受外源因素干擾等缺點，特別是目前食品中蛋白質的測定方法不能將植物蛋白和動物蛋白區分開來的問題，進而提供一種適用于牛奶或奶粉中的植物源摻加物的PCR檢測方法。

本發明解決其技術問題所采用的方案是：

一種牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，首先對待測產品的DNA模板進行提取，然后采用牛特異性引物和植物源特異性引物對提取的基因組DNA進行PCR擴增，同時對牛源DNA進行PCR擴增做為陰性對照組，對植物源DNA進行PCR擴增做為陽性對照組，然后對所有擴增產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳分析；最后根據被測產品孔出現的電泳帶與陽性對照組和陰性對照組進行比對，即可判定產品中是否添加了植物源摻加物。

牛特異性引物1和植物特異性引物2具有的核苷酸序列為：引物1-1?5′-GCC?ATA?TAC?TCT?CCT?TGG?TGA?CA-3′；引物1-2?5′-GTA?GGC?TTG?GGAATA?GTA?CGA-3′；引物2-1?5′-AAT?CTT?CTA?CTG?GTA?CAT?GGA?C-3′；引物2-2?5′-TCA?TCA?TCT?TTG?GTA?AAA?TCA?AG-3′。

PCR反應所用試劑還包括Taq酶、dNTP、10×緩沖液、MgCl₂和滅菌水。

所述植物源包括豆漿、豆粉、大豆分離蛋白或米湯。

所述的PCR引物濃度為0.1-0.4μmol/L。最佳方案為，所述的PCR引物濃度為0.2μmol/L。

所述PCR反應循環條件為預變性92～96℃3～8min；變性92～96℃20～40s，退火52～60℃20～40s，延伸72℃30～120s，共31～35個循環，最后延伸72℃3～10min。最佳方案為，所述PCR反應循環條件為預變性94℃4min；變性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃60s，共35個循環，最后延伸72℃7min。

進行瓊脂糖凝膠電泳分析采用的瓊脂糖凝膠的質量濃度為1.5～2.0％。最佳方案質量濃度為1.7％。

本發明采用分子生物學中的單一和雙重PCR技術，可以快速、準確、靈敏地從基因角度對牛奶和奶粉中植物源成分的摻入情況進行定性和半定量分析，為市場監督部門和檢驗檢疫部門提供技術保障。此方法操作簡單，費用低，耗時短，特異性好，靈敏度高，重復性好，能檢測到牛奶中摻入的植物成分低至0.1％，適于推廣應用。

具體實施方式

下面詳細闡述本發明優選的實施例。

實施例一：

本實施例所述檢測方法依次包括以下步驟：

a.對待測產品的DNA模板進行提取，即，提取產品基因組的DNA。

產品的DNA提取方法可以是現有技術中的任意一種公知方法，比如CTAB法、SDS法，也可以是本申請人于2011年4月1日申請的、申請號為201110081615.8、名稱為“一種大豆分離蛋白基因組DNA的提取方法”中所闡述的方法，區別只在于用本發明所述的牛奶或乳粉替換上述申請中的大豆分離蛋白。申請人在此將該方法闡述如下：

首先，將預先加入了已知量豆粉(添加量后面闡述)的待測奶粉與TE緩沖液(濃度不限)充分混合制成TE混合液(混合比例無需限定)，所述TE緩沖液也可以用水代替，目的只在于使其成為液體；

然后，加入液體二倍體積的異硫氰酸胍裂解液，充分混勻，室溫裂解，裂解時間為20～60min。所述異硫氰酸胍裂解液中含50～100mM?pH?6.0～8.0Tris-HCl；10～100mM?pH?8.0EDTA；5M異硫氰酸胍；體積含量1.3％TritonX-100。

第三步：采用酚、氯仿/異戊醇抽提蛋白，所述的酚、氯仿/異戊醇的體積比例為25∶24∶1，所述的氯仿/異戊醇的體積比例為24∶1。