[發明專利]一種基于PRRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒及制備方法

無效

• 申請號: 201110189010.0
• 申請日: 2011-07-07
• 公開（公告）號: CN102353778A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 王開功;陳軍義;程振濤;文明;周碧君;方英
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明涉及一種基于PRRSV?GP5?蛋白的iELISA試劑盒及制備方法。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome,?PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus,?PRRSV）引起的豬的一種高度傳染性疾病。自2006年我國爆發了由PRRSV變異株引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（Highly?pathogenic?porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome,?HP-PRRS），其與經典豬繁殖與呼吸綜合征相比，主要表現為：發病豬持續高溫41℃以上；各年齡段豬均可出現急性死亡；母豬流產率可達30%以上；仔豬表現為發病率高達100%，死亡率高達50%以上。我國農業部于2008年底將其列為一類動物傳染病。

目前國內對PRRS的防控主要采取疫苗免疫為主，使豬群產生免疫抗體以抵御PRRS侵襲，降低養豬場的風險。而當前部分豬場在免疫PRRS疫苗后，豬群仍有PRRS發生。因此能合理客觀及時評估豬場PRRS疫苗免疫效果，為豬群PRRS防控提供科學依據顯得尤為重要。PRRS疫苗免疫機體后產生中和抗體及非中和抗體，其中中和抗體能夠與病毒表面的抗原結合，從而阻止該病毒黏附機體靶細胞受體。故豬體內始終保持一定水平的PRRSV中和抗體，對于維持豬群健康具有重要意義。目前已經證明PRRSV結構蛋白中可以產生特異性中和抗體的有GP3、GP4和GP5蛋白，M蛋白也可能產生中和抗體，其中GP5蛋白被公認為是機體產生保護性體液免疫的主要蛋白。

通過對國內市場使用的PRRS血清抗體檢測試劑盒調查顯示，主要有PRRS全病毒蛋白和N蛋白為抗原包被的ELISA檢測試劑盒。前者可檢測PRRSV的各種抗體水平，能夠全面體現PRRSV抗體總水平；后者則檢測PRRSV?N蛋白的抗體，可以體現早期抗體及主要結構蛋白N抗體水平，但是均不能有效說明機體內特異性中和抗體水平，不能客觀地體現機體抵抗病毒的能力和疫苗免疫效果。因此有必要開發出一種能檢測PRRSV?GP5蛋白產生的特異性抗體的商品化試劑盒。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于，選取核苷酸同源性較高的HP?PRRSV?GZJL株，通過PRRSV?GP5基因原核表達載體的構建與表達，建立基于表達產物PRRSV?GP5蛋白的iELISA方法，并進行條件優化，以便制備成商品化iELISA試劑盒。該iELISA試劑盒的發明，將為PRRS疫苗免疫效果的評價，提供一種更加客觀和有效的指標，減少了生產中PRRS疫苗免疫的盲目性，為PRRS的免疫防控提供技術支撐。

基于PRRSV?GP5蛋白的iELISA試劑盒其組成包括：50~200μL重組蛋白包被、包被緩沖液25mL-40mL、酶標二抗300-500μL、1×PBST緩沖液800mL-1000mL、陽性對照1mL、陰性對照1mL、封閉緩沖液25mL-40mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和終止液10mL-15mL。?

所述的重組蛋白包被為重組蛋白使用包被緩沖液稀釋為1.8?mg/100μL?~3?mg/100μL；重組蛋白為PRRSV?GP5基因通過大腸桿菌BL21（DE3）表達系統獲得GP5蛋白，并通過His·Bind?Purification?Kit進行重組蛋白純化，經SDS-PAGE分析后得到純化目的蛋白；包被緩沖液為：Na₂CO₃?1.59?g、NaHCO₃?2.93?g溶于去離子水中，定容至1000?mL，調至?p?H?9.5～9.8。

所述的酶標二抗為：羊抗豬IgG-HRP。

所述的1×PBST緩沖液為：?NaCl?8.0?g、KCl?0.2?g、KH₂PO_4?0.2?g、Na₂HPO₄·12H₂O?2.9?g、Tween-20?0.5?mL溶于800?mL蒸餾水，調整pH為7.2～7.6，定容至1000?mL。

所述的陽性對照為通過PRRS分離毒臨床感染豬獲得的高免血清，使用時用血清稀釋液按1:10～1:200倍稀釋；所述的陰性對照為未感染且未免PRRS疫苗的豬血清，稀釋度為1:10～1:200。