[發明專利]一種基于PRRSV GP5蛋白的iELISA試劑盒及制備方法

無效

• 申請號: 201110189010.0
• 申請日: 2011-07-07
• 公開（公告）號: CN102353778A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 王開功;陳軍義;程振濤;文明;周碧君;方英
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

1.一種基于PRRSV?GP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于：其組成包括：重組蛋白包被50~200μL、包被緩沖液25mL-40mL、酶標二抗300-500μL、1×PBST緩沖液800mL-1000mL、陽性對照1mL、陰性對照1mL、封閉緩沖液25mL-40mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和終止液10mL-15mL。

2.根據權利要求1所述一種基于PRRSV?GP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于：所述的重組蛋白包被為重組蛋白使用包被緩沖液稀釋為1.8?mg/100μL?~3?mg/100μL；重組蛋白為PRRSV?GP5基因通過大腸桿菌BL21（DE3）表達系統獲得GP5蛋白，并通過His·Bind?Purification?Kit進行重組蛋白純化，經SDS-PAGE分析后得到純化目的蛋白；包被緩沖液為：Na₂CO₃?1.59?g、NaHCO₃?2.93?g溶于去離子水中，定容至1000?mL，調至?p?H?9.5～9.8。

3.根據權利要求1所述一種基于PRRSV?GP5?蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于：所述的酶標二抗為：羊抗豬IgG-HRP。

4.根據權利要求1所述一種基于PRRSV?GP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于：所述的1×PBST緩沖液為：?NaCl?8.0?g、KCl?0.2?g、KH₂PO_4?0.2?g、Na₂HPO₄·12H₂O?2.9?g和Tween-20?0.5?mL溶于800?mL蒸餾水，調整pH為7.2～7.6，定容至1000?mL。

5.根據權利要求1所述一種基于PRRSV?GP5蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于：所述的陽性對照為通過PRRS分離毒臨床感染豬獲得的高免血清，使用時用血清稀釋液按1:10～1:200倍稀釋；所述的陰性對照為未感染且未免PRRS疫苗的豬血清，稀釋度為1:10～1:200。

6.根據權利要求1所述一種基于PRRSV?GP5?蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于：所述的封閉緩沖液為：BSA0.3?g（0.1～0.5?g）溶于100?mL?PBST緩沖液；所述底物液A為：Na₂HPO₄?14.60?g、檸檬酸?9.33?g和過氧化氫脲?0.52?g，溶于三蒸水，并定容至1000?mL，調至?p?H?5.0～5.4；所述底物液B為：TMB?20mg和無水乙醇10?mL，加雙蒸水至1?000?mL，過濾除菌，無菌分裝。

7.根據權利要求1所述一種基于PRRSV?GP5?蛋白的iELISA試劑盒，其特征在于：所述的終止液為：0.2?%～0.3%?HF溶液。

8.如權利要求1-7任一項所述的一種基于PRRSV?GP5?蛋白的iELISA試劑盒的制備方法，其特征在于：它包括以下步驟：

原核表達系統表達融合蛋白His-dGP5，并經His·Bind?Purification?Kit

純化得到融合蛋白，應用SDS-PAGE和Western-blotting分析其純化效果及反應原性；

第二，步驟一的純化融合蛋白His-dGP5作為包被抗原，進行抗原包被液濃度、抗原包被條件、封閉液、血清稀釋度、封閉時間、酶標二抗稀釋濃度和顯色反應時間iELISA的條件的優化；

第三，取40份已知PRRS抗體陰性的豬血清，按步驟二確定的最佳反應條件，進行iELISA反應；樣本OD₆₃₀值≥陰性樣本OD₆₃₀值的平均值（X）+3（標準差），可在99%的水平上判為陽性，當樣本OD₆₃₀值＜陰性樣本OD₆₃₀值的平均值（X）+3（標準差）時，判為陰性。