[發明專利]一種雌性生殖干細胞的體外分離及培養方法

有效

• 申請號: 201110185764.9
• 申請日: 2011-07-05
• 公開（公告）號: CN102250830A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 華進聯;胡玥;白耀富
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種雌性生殖干細胞的體外分離方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)分離細胞

將從無菌采集的卵巢中分離的卵巢生殖上皮剪碎至碎塊，用包含體積分數10％FBS的DMEM/F12培養液重懸2～3次，靜置之后得到下層的組織團；然后用包含質量分數0.1％的Collagenase?I、10μg/ml?DNase和質量分數0.1％透明質酸酶的混合液消化處理組織團2～3次，每次20～30分鐘，再用包含體積分數10％FBS的DMEM/F12培養液重懸，分離得到卵巢源生殖細胞；

2)雌性生殖干細胞的原代培養

將得到的卵巢源生殖細胞以2×10⁵個/mL的密度接種在經質量分數0.2％的明膠37℃包被30min的塑料培養皿，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；

所述雌性生殖干細胞分離培養液以DMEM/F12培養基為基礎培養基，還包括以下組分：體積分數20％的胎牛血清與血清替代品(KSR)當中的一種、2mmol/L?L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、0.1mmol/L非必需氨基酸、5～10ng/mL的堿性成纖維生長因子、2.5μmol/L?BIO(6-bromoindirubin-30-oxime)、100IU/ml青霉素和100mg/mL鏈霉素；

培養12h后將未貼壁的細胞轉到經Matrigel基質膜4℃包被1h的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；

未貼壁的細胞第一次轉移培養12h后，將轉移培養后再次未貼壁的細胞轉移培養到經Matrigel基質膜4℃包被1h的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；

未貼壁細胞第二次轉移培養后，2d更換1次培養液；細胞生長3～7d后，開始出現致密胚胎干細胞樣集落；

3)雌性生殖干細胞的傳代培養

待致密胚胎干細胞樣集落生長至周邊開始出現分化細胞時，將致密胚胎干細胞樣集落吸出，在PBS中洗滌2次；再移到TrypLE細胞消化液或質量分數0.05％的胰蛋白酶中消化2～3min，并吹吸5～20次；將離散開的單細胞或小細胞團轉移到經Matrigel基質膜4℃包被1～2h的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養；

培養3～7d后，開始出現致密胚胎干細胞樣集落，即為雌性生殖干細胞。

2.一種雌性生殖干細胞的體外培養方法，其特征在于，將雌性生殖干細胞接種到MEF飼養層上，培養液以DMEM/F12培養基為基礎培養基，還包括以下組分：體積分數20％的血清替代品、2mmol/L谷氨酰胺、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、100IU/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素、質量分數1％的非必需氨基酸、2.5μmol/L?BIO、5～10ng/mL堿性成纖維生長因子和質量分數1％的ITS；2～3d更換一次培養液。