[發(fā)明專利]一種芽孢桿菌微生態(tài)制劑及其液固結(jié)合發(fā)酵制備工藝

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110184359.5
• 申請(qǐng)日: 2011-07-04
• 公開（公告）號(hào): CN102409007A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉晉生;孫駿躍;宋詼;譚明;李麗;劉陽(yáng);鄭雯;徐健勇;吳雅倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津市育琪生物技術(shù)有限公司;天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A23K1/16;C12R1/125;C12R1/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌為主的微生態(tài)制劑，還涉及這種微生態(tài)制劑的液固結(jié)合發(fā)酵制備工藝。

背景技術(shù)

微生態(tài)制劑是采用有益微生物，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵、干燥、加工等工藝制成含有活菌的活菌劑或者包含菌體及其代謝產(chǎn)物的制劑，具有抗病、治病、促生長(zhǎng)等功能，而且具有無殘留污染，無副作用和不產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是微生態(tài)制劑的理想菌種，包括在我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布的可直接飼喂動(dòng)物的飼料級(jí)微生物添加劑中。它們耐酸，耐堿，耐高溫，在制粒過程中及動(dòng)物胃腸道中均能保持穩(wěn)定；枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多種氨基酸，從而提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，縮短飼養(yǎng)周期；并且能促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌和梭菌等厭氧菌的生長(zhǎng)，有效抑制腸道中腸桿菌和腸球菌等需氧菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)宿主腸道正常菌群生長(zhǎng)，維持腸道微生態(tài)平衡。

傳統(tǒng)微生態(tài)制劑的制備多采用固態(tài)發(fā)酵工藝，固態(tài)發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本較低，但存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，發(fā)酵過程易污染，干燥過程能耗大等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：針對(duì)現(xiàn)有制備芽孢桿菌微生態(tài)制劑的技術(shù)工藝活菌數(shù)不穩(wěn)定，易污染雜菌等缺陷，提出一種新的制備芽孢桿菌微生態(tài)制劑的工藝方法。該方法采用液固結(jié)合制備芽孢桿菌微生態(tài)制劑，工藝簡(jiǎn)單，不易污染雜菌，活菌數(shù)穩(wěn)定，可達(dá)10⁸個(gè)活菌/g以上。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明提供一種微生物飼料添加劑及其制備方法。其特征是：以液體培養(yǎng)基A，在35~37℃條件下分別培養(yǎng)枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus?licheniformis）17~24小時(shí)，制成擴(kuò)培液，菌數(shù)達(dá)到10¹⁰/mL以上，并按照重量比5~10%與經(jīng)滅菌后的固體培養(yǎng)基B進(jìn)行混勻接種，隨后在35~37℃條件下進(jìn)行超短期（1~2小時(shí)）固體發(fā)酵，利用了芽孢桿菌在環(huán)境變化時(shí)容易產(chǎn)生芽孢的特點(diǎn)，使代謝活躍的菌體在固體培養(yǎng)基中經(jīng)短期發(fā)酵后迅速成熟并生成芽孢。隨后進(jìn)行粉碎、包裝，制成微生物飼料添加劑。

液體培養(yǎng)基A的組成為：1.0%（m/V）酵母浸粉，1.6%（m/V）蛋白胨，0.5%（m/V）NaCl，水，pH6.0~7.0。

固體培養(yǎng)基B的組成為：1.2%（m/m）葡萄籽提取物，98.8%（m/m）麩皮。

制備步驟如下。

出發(fā)菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis），購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），保藏編號(hào)：CICC?20037；地衣芽孢桿菌（Bacillus?licheniformis）購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），保藏編號(hào)CICC?23584。

1）一級(jí)種子培養(yǎng)：一級(jí)液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl?5g/L，pH?6.0~7.0，121℃滅菌20min；培養(yǎng)條件：將枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別接種于固體LB培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種于10mL液體種子培養(yǎng)基，于旋轉(zhuǎn)式搖床200rpm，37℃培養(yǎng)14~18h，得到一級(jí)種子液；

2）二級(jí)種子培養(yǎng)：二級(jí)液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl?5g/L，pH?6.0~7.0，121℃滅菌20min；培養(yǎng)條件：于1L三角瓶中裝入200mL二級(jí)液體種子培養(yǎng)基，分別接種1%~2%上述一級(jí)種子液，37℃，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵10~18h，得到二級(jí)種子液；

3）高密度液體發(fā)酵：補(bǔ)料液：葡萄糖500g/L，蛋白胨200g/L；液體培養(yǎng)基：蛋白胨16g/L，酵母粉10?g/L，NaCl?5?g/L，pH?6.0~7.0，121℃滅菌20min；培養(yǎng)條件：于5~50L發(fā)酵罐中裝入50%體積的液體培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)基體積1~2%的上述二級(jí)種子液，37℃，攪拌200rpm培養(yǎng)6~8h后，開始流加補(bǔ)料液，流速50mL/min，發(fā)酵至17~24h，停止發(fā)酵，得到高密度菌體發(fā)酵液；

4）固相載體處理：固相培養(yǎng)基（麩皮和質(zhì)量比1%~2%的葡萄籽提取物）采用微波干燥殺菌，功率10kW時(shí)間30min，水分含量≤5%；

5）液固混配：將步驟3）中所得的菌體發(fā)酵液按照重量比1~10%與步驟4）中處理后的固相培養(yǎng)基分別混合，充分拌勻，得到發(fā)酵曲；

6）快速固體發(fā)酵：將步驟5）中所得發(fā)酵曲在35~37℃條件下靜置1~3h，進(jìn)行快速固體發(fā)酵，使菌種成熟并產(chǎn)生芽孢，得到固體發(fā)酵產(chǎn)物；