[發明專利]改型擴展青霉脂肪酶基因及其構建和表達方法

無效

• 申請號: 201110183472.1
• 申請日: 2011-07-01
• 公開（公告）號: CN103014036A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 王劍英;陳健;王宏;蘭瑛
• 申請（專利權）人: 深圳市綠微康生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/20;C12N15/66;C12N15/63
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 胡堅

技術領域

本發明申請涉及一種擴展青霉脂肪酶基因片段及其構建和表達方法，該基因能夠高效表達的脂肪酶，屬于基因工程技術領域。

背景技術

近年來脂肪酶(Lipase?EC)在工業應用方面取得了很大進展，堿性脂肪酶是在堿性條件下水解的脂肪酶，它可以水解天然油脂，產生脂肪酸和甘油，是一種專門在異相系統油水接口上水解特殊酯類的酶。堿性脂肪酶具有對底物水解效率高、反應溫和、無毒、能在一定條件下水解脂肪作用等優點，已經在洗滌劑、造紙、制革、食品、紡織及輕工業等領域得到廣泛的應用，并已經成為全世界酶制劑市場上重要的品種。

在現有的技術中，通過對大量的微生物菌種進行選育，已經獲得了產堿性脂肪酶能力較強的擴展青霉(P.expansium)菌株，其產脂肪酶的能力已經得到大幅度的提高。

另外，現有脂肪酶產生菌主要以細菌為主，兼以少量真菌，而這些菌種中有些菌株產生的脂肪酶由于其最適酶解溫度比較低，中溫條件下不穩定、使用與保藏中同樣消耗能量而使其應用受到限制；而且，目前的產脂肪酶基因尚存在著表達效率不高、不穩定的缺陷，獲得的脂肪酶也存在著活性不高的缺點，這些都限制了脂肪酶的進一步推廣和應用。

發明內容

本發明申請即是針對目前在脂肪酶的技術中存在的上述不足之處，提供一種經過基因工程改造后的能夠穩定高效表達堿性脂肪酶的基因片段，本發明請的另一目的是提供含有該基因片段的質粒的構建和表達方法。

為了表述方便，下文中提到的“PEL”是指青霉的脂肪酶基因，“PgpdA”是指構巢曲霉強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子，“Tt?rpC”是指構巢曲霉色氨酸合成酶終止子，PtrpC為構巢曲霉色氨酸合成酶啟動子，這些和以下提到的質粒都是基因工程技術中常見的術語，這里不再贅述。

具體來說，本發明申請提供一種改型擴展青霉脂肪酶基因，所述的基因具有SEQ?ID?NO：1的堿基序列。

所述改型擴展青霉脂肪酶的編碼區序列(CDS序列)，所述的基因具有SEQ?IDNO：2的堿基序列。

其中，表達信號肽的核苷酸序列，有SEQ?ID?NO：3的堿基序列。

所述基因表達的擴展青霉脂肪酶的蛋白質序列(含胞外定位信號肽)，具有SEQID?NO：4的氨基酸序列。

其中，SEQ?ID?NO：5：MLFNYQSLLVGVSLISQALSAPILESR為信號肽序列。

信號肽經剪切后得到成熟肽序列，具有SEQ?ID?NO：6的氨基酸序列。

本發明申請所述的改型擴展青霉脂肪酶質粒的構建方法，包括下述的步驟：

1、獲得潮霉素抗性表達盒克隆至目標質粒上，獲得潮霉素抗性的重組質粒；

2、利用PCR技術分別擴增青霉的脂肪酶基因(PEL)、構巢曲霉強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PgpdA)和構巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)，得到有強啟動子驅動的PEL基因表達盒；

3、將該PEL基因表達盒插入到潮霉素抗性的重組質粒中，獲得含潮霉素篩選標記的PEL基因超表達載體。

所述的步驟1中的潮霉素抗性表達盒為構巢曲霉色氨酸合成酶啟動子(PtrpC)驅動的潮霉素磷酸轉移酶(hpt)基因表達盒。

所述的構建方法中，目標質粒包括pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300或pHB。

所述的構建方法中，步驟1中，獲得潮霉素抗性表達盒的方法包括PCR技術或限制性酶切技術。

所述的構建方法中，步驟2中，獲得青霉的脂肪酶基因(PEL)、構巢曲霉強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PgpdA)和構巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)的方法包括PCR擴增、限制酶克隆或化學合成技術克隆。

具體的，所述構建方法包括如下的步驟：

1)利用PCR技術或限制性酶切技術獲得潮霉素抗性表達盒并克隆到目標質粒上，獲得潮霉素抗性的重組質粒；

2)PCR擴增構巢曲霉強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PgpdA)后將PgpdA克隆至目標質粒，得到重組質粒；

3)PCR擴增脂肪酶基因(PEL)和構巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)，產物經凝膠回收后克隆至目標質粒的相應位點，得到含PEL基因表達盒的載體；

4)利用限制性酶切技術獲得PEL基因表達盒，然后克隆至含有潮霉素抗性的重組質粒上，獲得含潮霉素篩選標記的PEL基因超表達載體。

進一步的，所述構建方法包括如下步驟：