[發(fā)明專利]YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110181999.0
• 申請日: 2011-07-27
• 公開（公告）號: CN102230034A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發(fā)明（設計）人: 王忠發(fā);沈飆;王海;胡興娟
• 申請（專利權）人: 舟山市疾病預防控制中心;中華人民共和國舟山出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 舟山固浚專利事務所 33106
• 代理人: 范榮新

技術領域

本發(fā)明涉及的是一種YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒及檢測方法，包含酶或微生物的測定或檢驗方法及其所用的組合物或試紙領域。

背景技術

YHV是黃頭病毒（Yello?head?virus）的英文縮寫，它是一種有包膜的桿狀病毒，大小為150~170?nm×40~50nm，其基因組為單正鏈RNA，全基因序列長度26662bp（EU487200.1），主要編碼4種結構蛋白（170?kDa、135?kDa、67?kDa和22kDa）。人工感染實驗證明YHV能感染大多數(shù)養(yǎng)殖對蝦并能引起很高的死亡率，是一種嚴重威脅蝦養(yǎng)殖業(yè)的病原體，它引起的蝦黃頭病屬于國際獸疫局（International?office?of?Epizootic?Disease，OIE）?規(guī)定的必需上報的二類疫病。?1990年泰國首次發(fā)現(xiàn)YHV引起黑虎蝦（Black?tiger?shrimp）大量死亡，1992年該病在泰國境內(nèi)流行并導致蝦減產(chǎn)5000?噸，隨后在東南亞蔓延，最近在美洲也有發(fā)生。由于缺乏有效的防治措施，杜絕YHV流入我國境內(nèi)便成為關鍵，因此加強對外國進口的養(yǎng)殖對蝦的檢驗檢疫顯得十分重要。但目前我國使用的檢驗檢疫行業(yè)標準方法（SN/T?1151.4-2003）是一種早期的普通RT-PCR技術，存在著操作復雜、步驟繁多、容易污染、檢測時間長、靈敏度低、重復性差等多種缺點。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述不足，本發(fā)明所要解決的技術問題是如何簡化操作步驟、縮短檢測時間、提高檢測靈敏度，以此為目的而建立起快速熒光RT-PCR定量檢測YHV的方法，并提供YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒及檢測方法。

本發(fā)明提供的YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒，其中有以試劑瓶包裝的試劑，所包裝試劑包括：

名稱為熒光YHV-F的上游引物，其寡核苷酸序列是：5’-CGT?CCC?GGC?AAT?TGT?GAT-3’；

名稱為熒光YHV-R的下游引物，其寡核苷酸序列是：5’-GAG?AGA?CCA?GCG?GAG?AAC?CA-3’；

名稱為熒光YHV-P的TaqMan探針，其寡核苷酸序列是：5’-FAM-CCA?TCA?AAG?CTC?TCA?ACG?CCG?TCA?C?-TAMRA-3’。

本發(fā)明提供的YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒，其中所包裝的上、下游引物和TaqMan探針，有較強的特異性。YHV的RNA序列分析發(fā)現(xiàn)其基因結構與澳大利亞本土腮相關病毒(Gill-associatd?virus，GAV)高度相似，但本發(fā)明設計的上游引物、下游引物、TaqMan探針與擴增產(chǎn)物的序列經(jīng)Blast（在DNA數(shù)據(jù)庫中進行相似性比較的分析工具，Basic?Local?Alignment?Search?Tool的縮寫）程序比對確認與GAV的同源性分別為61.1%、75.0%、84.0%與74.7%?；而與以下來源不同的YHV標準毒株序列（FJ848674.1、FJ848673.1、EU977578.1、EU487200.1、EF648276.1、DQ978356.1、AF148846.1）的同源性均為完全一致。因此本發(fā)明設計的引物和探針能與來源不同的YHV發(fā)生特異性反應而與GAV則基本不可能發(fā)生非特異性反應。與現(xiàn)有技術《對蝦黃頭病毒(YHV)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測方法，中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準（SN/T?1151.4-2003）》相比，本發(fā)明試劑盒在應用中有檢測快速、實時定量、靈敏度高、特異性強、重復性好、操作簡單、不易污染等特點。

所說試劑盒中的各試劑濃度為反應濃度的倍數(shù)，各試劑的反應濃度是：

上游引物，熒光YHV-F??20?μM；

下游引物，熒光YHV-R??20?μM；

TaqMan探針，熒光YHV-P??10?μM。

所說試劑盒中的各試劑量為反應濃度下的反應量的倍數(shù)，各試劑的反應量：

濃度為20?μM的上游引物，熒光YHV-F???0.4?μl；

濃度為20?μM的下游引物，熒光YHV-R???0.4?μl；

濃度為10?μM的TaqMan探針，熒光YHV-P???0.4?μl?。

本發(fā)明提供的YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒，還包括以下試劑：

TaKaRa公司生產(chǎn)的2×One?step?RT-PCR?Buffer?Ⅲ；

TaKaRa公司生產(chǎn)的Ex?Taq?HS酶；