[發明專利]YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201110181999.0
• 申請日: 2011-07-27
• 公開（公告）號: CN102230034A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 王忠發;沈飆;王海;胡興娟
• 申請（專利權）人: 舟山市疾病預防控制中心;中華人民共和國舟山出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 舟山固浚專利事務所 33106
• 代理人: 范榮新

1.一種YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒，其特征是其中有以試劑瓶包裝的試劑，所包裝試劑包括：

上游引物，其寡核苷酸序列是：5’-CGT?CCC?GGC?AAT?TGT?GAT-3’；

下游引物，其寡核苷酸序列是：5’-GAG?AGA?CCA?GCG?GAG?AAC?CA-3’；

TaqMan探針，其寡核苷酸序列是：5’-FAM-CCA?TCA?AAG?CTC?TCA?ACG?CCG?TCA?C?-TAMRA-3’。

2.如權利要求1所述的YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒，其特征是所說試劑盒中的各試劑濃度為反應濃度的倍數，各試劑的反應濃度是：

上游引物??20?μM；

下游引物??20?μM；

TaqMan探針??10?μM。

3.如權利要求1所述的YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒，其特征是所說試劑盒中的各試劑量為反應濃度下的反應量的倍數，各試劑的反應量：

濃度為20?μM的上游引物???0.4?μl；

濃度為20?μM的下游引物???0.4?μl；

濃度為10?μM的TaqMan探針???0.4?μl?。

4.如權利要求1或2或3所述的YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒，其特征是還包括以下試劑：

TaKaRa公司生產的2×One?step?RT-PCR?Buffer?Ⅲ；

TaKaRa公司生產的Ex?Taq?HS酶；

TaKaRa公司生產的PrimeScript?RT?Enzyme?MixⅡ反轉錄酶混合物。

5.如權利要求4所述的YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒，其特征是所說試劑的包裝量是一個試驗反應量的倍數，各試劑的反應量是：

2×One?step?RT-PCR?Buffer?Ⅲ?10μl；

5U/μl?Ex?Taq?HS酶0.4μl；

RT?Enzyme?MixⅡ?0.4μl。

6.如權利要求5所述的YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒，其特征是還包括無RNase去離子水，其包裝量是一個反應量6.0?μl的倍數。

7.如權利要求3或5或6所述的YHV的熒光RT-PCT定量檢測試劑盒，其特征是各試劑的包裝量與反應量的倍數相等。

8.一種YHV的熒光RT-PCT定量檢測方法，先配制反應液，再進行擴增反應，最后由儀器自動計算結果并輸出定量數據；擴增反應所需要試管總數n與所要反應的模板數相同，模板數包括受檢樣本模板個數外、1個陰性對照模板、1個陽性對照模板、4~6個定量標準模板，則反應液配制量是反應所需要試管總數的用量與1管余量的和；其特征是所說的配制方法是在1.5ml無菌EP管中依次加入下列試劑的n+1倍：2×One?step?RT-PCR?BufferⅢ?10μl、TaKaRa?Ex?Taq?0.4μl、PrimeScript?RT?Enzyme?MixⅡ0.4μl、20?μM?上游引物0.4?μl、20?μM?下游引物0.4?μl、10?μM?TaqMan?探針0.4?μl、無RNase去離子水6.0?μl，混勻后以每管18μl分裝在n個玻璃毛細反應管中；所說上游引物的寡核苷酸序列是：5’-CGT?CCC?GGC?AAT?TGT?GAT-3’；下游引物的寡核苷酸序列是：5’-GAG?AGA?CCA?GCG?GAG?AAC?CA-3’；TaqMan探針的寡核苷酸序列是：5’-FAM-CCA?TCA?AAG?CTC?TCA?ACG?CCG?TCA?C?-TAMRA-3’；在進行擴增反應前在每個玻璃毛細反應管中加入2.0?μl模板，使反應總體積為20?μl，其中1個反應管中加陰性對照模板、1個反應管中加陽性對照模板、4~6個反應管中加定量標準模板，其余反應管中加受檢樣本模板；然后將所有擴增反應玻璃毛細管低速離心1分鐘，離心后的玻璃毛細管移入實時熒光PCT儀器中作擴增反應；所說擴增反應的條件是以反轉錄42℃?5min→預變性95℃?10s→變性95℃?5s→退火延伸60℃?20s為一個周期，共進行循環40個周期；其中溫度變化速率為20℃/s；在每個周期中延伸結束時收集熒光信號，儀器收集方式設為“SINGLE”，即單點收集；儀器檢測通道選擇“F1”，即熒光發光基團FAM的通道選擇吸收波長在485~530nm的熒光。