[發明專利]具有抑制纖溶酶活性的重組textilinin-1及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110178605.6
• 申請日: 2011-06-29
• 公開（公告）號: CN102850451A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 薛百忠;徐梅;楊宇;張宏杰;李娜;劉劍;邸偉慶;劉宏大;王宏英;薛雁
• 申請（專利權）人: 遼寧諾康生物制藥有限責任公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C12N15/15;C12N15/81;C12N15/85;A61K38/57;A61P7/04
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

技術領域：

????本發明涉及一種基因重組方法制備具有抗纖溶酶活性的多肽textilinin-1。其關鍵是textilinin-1（Q8008）基因的密碼子優化、合成、克隆、表達及產物的發酵表達和分離純化制備。重組textilinin-1可以作為止血藥，用于控制手術過程中纖維蛋白被纖溶酶溶解導致的失血過多。

背景技術：

臨床上，外科手術中如何減少血液的流失是需要密切關注的重要事件，尤其是對手術時間較長的心肺旁路手術，就更應該采取一定的措施，避免和減少患者的大量出血。減少外科手術中血液的用量能有效地降低因輸血產生的大量問題和避免經血液傳播疾病的感染，如乙型肝炎病毒，人免疫缺陷型病毒（HIV）和變型的克羅伊茨費爾特-雅各布病等。

止血藥aprotinin（抑酞酶）在國外被常用于心臟外科手術中，主要用于體外循環下實施冠狀動脈旁路移植術(CABG)的病人，以減少手術過程中的出血，并相應降低輸血需求。但aprotinin有明顯的副作用，可產生嚴重的不良反應，主要包括過敏性休克、心肌缺血、血栓形成、心力衰竭、腎功能異常、急性腎衰竭等，目前已經停止使用。

目前在國內還沒有發現有同類產品的研究和報告。澳大利亞研究的textilinin-1仍處于實驗室研究階段。初步試驗結果證明：textilinin-1與aprotinin相比，在相同用量的情況下，其止血過程更安全可靠。

textilinin-1（Txln-1），是一種Kunitz-型蛋白酶抑制劑，是從澳大利亞棕蛇Pseudonaja?textilis?textilis?中提取的，具有59個氨基酸，分子量為6.7?kDa的多肽。這個分子被建議作為在外科手術中aprotinin的替代藥物。雖然textilinin-1與aprotinin在蛋白序列上相似度只有47%。但在這兩種多肽中，六對二硫鍵是高度保守的。因此，預期他們的分子空間折疊是相似的，只是分子表面特性有些不同。

textilinin-1?和aprotinin都具有強烈地抑制plasmin、elastase和trysin活性的作用。研究發現aprotinin對urokinase，thrombin和kallikrein比textilinin-1強。被textilinin-1抑制的plasmin將很快地被逆轉，并比aprotinin易于控制，這可有助于控制血漿和損傷部位的抗纖維蛋白溶解活性。textilinin-1的這一特點降低了由于強烈抑制纖溶酶（aprotinin）而導致的血栓風險，使它成為減少手術中血液損失的安全治療性藥物。并且，由于textilinin-1相對于plasmin有更強的專一性，可以在較高的劑量使用而沒有由于酶特異性差而導致的安全風險。與主要用于心臟外科手術中aprotinin相比，Textilinin-1可能作為更可靠和更安全的止血用藥。

textilinin-1可引起預期的血塊溶解抑制作用。在同樣的摩爾濃度下，aprotinin的抑制作用顯著低于textilinin-1。這也是早期用血漿凝塊溶解實驗所證明的。textilinin-1可抑制纖溶酶活性，并在小動物模型中能減少出血。textilinin-1同aprotinin一樣，在5微摩的濃度下就能產生幾乎完全抑制tPA誘導產生的全血凝塊纖維蛋白的溶解。aprotinin能顯著增加血漿aPTT，而血漿aPTT則不受textilinin-1的影響。在小鼠尾靜脈出血動物模型中，靜脈給藥，textilinin-1和aprotinin都能起到相同的減少血液損失的作用。但textilinin-1可使小鼠止血時間更短。說明textilinin-1值得進一步研究，有望開發成為替代aprotinin的藥物。