[發明專利]一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法

無效

• 申請號: 201110178452.5
• 申請日: 2011-06-29
• 公開（公告）號: CN102851302A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 范銘琦
• 申請（專利權）人: 范銘琦
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N9/82
• 代理公司: 上海三方專利事務所 31127
• 代理人: 吳干權

1.一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法，其特征在于包括以下步驟：

a、采用PCR技術從沃氏菌的基因組DNA中擴增出天門冬酰胺酶的全長或部分片段的DNA，該DNA片段的5′和3′端各帶有至少一個特定的限制性內切酶點；

b、將上述天門冬酰胺酶的全長或部分片段的DNA用DNA連接酶連接到克隆質粒中；

c、利用特定的限制性內切酶從克隆質粒中切割出天門冬酰胺酶的全長或部分片段的DNA，再連接到已用同樣的限制性內切酶消化后的原核細胞表達質粒中；

d、將上述的含有天門冬酰胺酶的全長或部分片段的DNA的表達質粒轉染到大腸桿菌中，在抗生素選擇培養基中培養此轉染的細菌以擴增含有天門冬酰胺酶的全長或部分片段的DNA的表達質粒，在培養基中加入誘導物誘導重組天門冬酰胺酶的合成；

e、收集轉染的菌體，離心分離出菌體；破碎細菌，釋放重組天門冬酰胺酶；

f、用二步柱層析法分離精制重組沃氏菌天門冬酰胺酶；

g、用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測鑒定重組沃氏菌天門冬酰胺酶，用考馬斯亮藍染色后可見一個35kDa的蛋白質條帶與計算值一致。

2.如權利要求1所述的一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法，其特征在于所述質粒所含的抗菌素的抗性基因，抗菌素可選為氨芐青霉素或羧芐青霉素或卡那霉素，質粒所含的啟動子為T7，T7lac，T7lacUV5或其他含T7的雜合啟動子。

3.如權利要求1所述的一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法，其特征在于所述二步柱層析法包括以下步驟：

1)、用陰離子交換柱層析法吸附雜志蛋白，收集不被吸附的重組天門酰胺酶，并進行超濾濃縮；

2)、經過上述分離步驟得到的重組天門冬酰胺酶再用疏水色譜層析進行精制。

4.如權利要求1所述的一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法，其特征在于所述制備重組沃氏菌天門冬酰胺酶的表達菌體，包括在合適細菌培養基下的表達菌體的培養，離心收集細胞，接著將細胞重新混懸于含50-150mMTris，pH?7.5，50-100mM?NaCl，0.1-1mM?DTT，1mM?EDTA的緩沖液中。

5.如權利要求1或4所述的一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法，其特征在于所述表達菌體混懸液采用溶菌酶處理，再進行破碎；或直接破碎；破碎方法可以使超聲波破碎，French?Press壓力破碎或用非離子表面活性劑直接溶解細胞膜，釋放出胞內蛋白。

6.如權利要求1所述的一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法，其特征在于所述制備重組沃氏菌天門冬酰胺酶與標簽多肽/蛋白結合成融合蛋白，以方便純化，所述標簽多肽/蛋白采用多聚His或GST或Flag或MBP或S?tag或Strep?tag或T7tag。