[發明專利]一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法

無效

• 申請號: 201110178452.5
• 申請日: 2011-06-29
• 公開（公告）號: CN102851302A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 范銘琦
• 申請（專利權）人: 范銘琦
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N9/82
• 代理公司: 上海三方專利事務所 31127
• 代理人: 吳干權

[技術領域]

本發明涉及生物醫藥的基因重組領域，具體地說是一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法。

[背景技術]

天門冬酰胺酶是一類能將L-天門冬酰胺(L-asparagine)轉化為天門冬氨酸(aspartic?acid)的酶；此外該酶還通常具有較低的谷氨酰胺酶的活性(glutaminase?activity)。

天門冬酰胺酶主要用于治療急性淋巴細胞白血病(Acute?lymphocytic?leukemia)等血癌疾病，是急性淋巴細胞白血病治療中的重要藥物。此外對惡性淋巴瘤也有較好的療效。其主要機理是：癌細胞不能產生天門冬酰胺，但正常細胞可以；天門冬酰胺酶能降解天門冬酰胺成天門冬氨酸，從而使癌細胞因缺乏必須的天門冬酰胺而死亡。目前臨床上使用的產品大多數是大腸桿菌(E.coli)來源的天門冬酰胺酶，也有采用歐氏菌(Erwinia?chrysanthemi)來源的天門冬酰胺酶；這兩個品種均已列入中國藥典(中國藥典二部，2010年)。但沃氏菌的天門冬酰胺酶尚未開發成新藥，已有研究表明：與其它來源的天門冬酰胺酶相比，該酶底物專一性更佳，穩定性也較好，并和臨床上已有的產品無免疫交叉性，因而具有潛在的臨床使用價值。

傳統的天門冬酰胺酶的制備法多為從菌體中直接提取，但目的酶在菌體中的比例不高，而且該方法涉及有機溶劑的使用，工藝步驟多，質量控制困難。沃氏菌的天門冬酰胺酶最初也由菌體中直接提取，但該菌為厭氧菌，培養較之需氧菌更為困難，同樣也有產率低的缺陷。

[發明內容]

本發明的目的是利用基因重組的方法獲得重組沃氏菌的天門冬酰胺酶。

為了實現上述目的，本發明設計一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法，其特征在于包括以下步驟：

a、采用PCR技術從沃氏菌的基因組DNA中擴增出天門冬酰胺酶的全長或部分片段的DNA，該DNA片段的5′和3′端各帶有至少一個特定的限制性內切酶點；

b、將上述天門冬酰胺酶的全長或部分片段的DNA用DNA連接酶連接到克隆質粒中；

c、利用特定的限制性內切酶從克隆質粒中切割出天門冬酰胺酶的全長或部分片段的DNA，再連接到已用同樣的限制性內切酶消化后的原核細胞表達質粒中；

d、將上述的含有天門冬酰胺酶的全長或部分片段的DNA的表達質粒轉染到大腸桿菌中，在抗生素選擇培養基中培養此轉染的細菌以擴增含有天門冬酰胺酶的全長或部分片段的DNA的表達質粒，在培養基中加入誘導物誘導重組天門冬酰胺酶的合成；

e、收集轉染的菌體，離心分離出菌體；破碎細菌，釋放重組天門冬酰胺酶；

f、用二步柱層析法分離精制重組沃氏菌天門冬酰胺酶；

g、用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測鑒定重組沃氏菌天門冬酰胺酶，用考馬斯亮藍染色后可見一個35kDa的蛋白質條帶與計算值一致。

所述質粒所含的抗菌素的抗性基因，抗菌素可選為氨芐青霉素或羧芐青霉素或卡那霉素，質粒所含的啟動子為T7，T7lac，T7lacUV5或其他含T7的雜合啟動子。

所述二步柱層析法包括以下步驟：

1)、用陰離子交換柱層析法吸附雜志蛋白，收集不被吸附的重組天門酰胺酶，并進行超濾濃縮；

2)、經過上述分離步驟得到的重組天門冬酰胺酶再用疏水色譜層析進行精制。

所述制備重組沃氏菌天門冬酰胺酶的表達菌體，包括在合適細菌培養基下的表達菌體的培養，離心收集細胞，接著將細胞重新混懸于含50-150mM?Tris，pH7.5，50-100mM?NaCl，0.1-1mM?DTT，1mM?EDTA的緩沖液中。

所述表達菌體混懸液采用溶菌酶處理，再進行破碎；或直接破碎；破碎方法可以使超聲波破碎，French?Press壓力破碎或用非離子表面活性劑直接溶解細胞膜，釋放出胞內蛋白。

所述制備重組沃氏菌天門冬酰胺酶與標簽多肽/蛋白結合成融合蛋白，以方便純化，所述標簽多肽/蛋白采用多聚His或GST或Flag或MBP或S?tag或Streptag或T7tag。

本發明與現有技術相比，其優點在于：工藝步驟少，易控制產品質量且能大量制備。

[附圖說明]

圖1為本發明用于擴增沃氏菌天門冬酰胺酶的DNA的PCR引物序列；

圖2為本發明的沃氏菌天門冬酰胺酶的PCR擴增DNA片段；

圖3為本發明的表達載體；

圖4為本發明的含沃氏菌天門冬酰胺酶DNA的表達載體；