[發明專利]一種蟬棒束孢菌株的分子鑒定方法

無效

• 申請號: 201110178274.6
• 申請日: 2011-06-28
• 公開（公告）號: CN102851353A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 鮑曉妮;陳超;魏寧;張健;江三多;孫長勝
• 申請（專利權）人: 上海泛亞生命科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及了建立一種蟬棒束孢菌株(保藏號：CGMCCNO.3453)的分子生物學的鑒定方法。

背景技術

蟬花是蟬棒束孢Isaria?cicadae?Miquel的通用名(蟬棒束孢Isaria?cicadae?Miquel＝蟬擬青霉Paecilomyces?cicadae(Miq.)Samson)，是某些蟬若蟲受蟬棒束孢菌寄生后形成的產物，是一種菌蟲復合體，由Miquel于1838年定名。

本專利涉及的蟬棒束孢菌株(Isaria?cicadae?Miquel)已于2009年11月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)注冊保藏，保藏號為CGMCC?NO.3453。

本菌株是從云南三門源頭采集野生蟬花標本，經人工培養和反復純化分離獲得本專利所述的蟬棒束孢菌株(CGMCC?NO.3453)。他屬于半知菌亞門Deuteromycotina，絲孢綱Hyphomyceles，束梗孢目Stilbellales，束梗孢科Stilbellaceae，棒束孢屬ISaria。其主要形態特征為：

在PDA培養基上25℃培養10天，菌落圓形，平展，初絮狀，后粉狀，白色至淺黃色，背面淺黃色，直徑5～6厘米。菌絲無色，分枝，具隔膜，寬1.2～2.5μm。分生孢子梗多分枝，寬3.0～5.5μm，由每輪2～5個產孢細胞組成輪狀分枝。產孢細胞瓶形，基部球狀膨大，向上變細窄，4.5～6.5×2.5～3.5μm。分生孢子圓柱形，單細胞，無色，平滑，鏈生，直或彎曲，6.5～8.8(～11.0)×2.5～3.5μm。

本菌株經試驗證實其培養物易生長和產量高的特點，經藥理學實驗顯示具明顯的鎮痛、鎮驚和解熱等功效，且含有豐富生物活性物質和營養素，是一種功效與冬蟲夏草近似的珍貴藥材，具有廣泛開發藥品和保健品的前途。

由于地理環境來源不同，寄主不同可造成蟬棒束孢菌株間的次生代謝產物具有較大的差異，而這種差異依靠傳統鑒別方法難以區別，因為傳統方法對蟲生真菌的鑒別和種內變異及菌系特征分析均采用形態特征、生長特性及生物活性物質測定進行區別鑒定，缺乏從菌株的基因水平上確定種的本質所在，往往出現較多鑒定誤差，所以迫切需要建立一種較本質、較科學、較先進的鑒別技術。本專利就是克服以上不足，運用分子遺傳學技術，并結合生物信息學分析，建立一種以基因組中內轉錄間隔區(ITS)的DNA序列為基礎的的分子標志，為本菌株的種屬鑒定提供一種分子水平上、快速、可靠、精確、科學及不受環境影響的鑒別菌株新技術。

發明內容

本發明的目的是提供一種蟬棒束孢菌株(Isaria?cicadae?Miquel)CGMCC?NO.3453的分子生物學的鑒定方法。

本發明的具體方法步驟如下：

1)提取待測菌株的基因組DNA；

2)采用ITS5和ITS4這對引物對步驟1)提取的基因組DNA作PCR擴增；

引物序列如下：

ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCCTAACAAGG-3’(SEQ?ID?NO：1)

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ?ID?NO：2)：

3)擴增產物在瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，觀察DNA擴增結果；

4)對擴增獲得的DNA片段進行回收和純化；

5)將純化后DNA片段做雙向測序；

6)將測得DNA序列與蟬棒束孢菌株CGMCC?NO.3453的ITS序列(SEQ?ID?NO：3)作比對；

7)若比對結果表明，待測菌株ITS序列與SEQ?ID?NO：3的內容和排列順序完全一致時，則待測菌株就是蟬棒束孢CGMCC?NO.3453菌株。

步驟2)所述PCR擴增體系為：每20ul反應體系，內含1×EX?PCR緩沖液、1.5mMdNTP、正反向引物各10pmol、EX?Tag酶1u和DNA樣本200ng及加ddH20至20ul。

步驟2)所述PCR擴增條件為：94℃3分鐘為1個循環；94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒為38個循環；最后72℃7分鐘延伸。