[發明專利]一種構建T載體的方法

無效

• 申請號: 201110177458.0
• 申請日: 2011-06-28
• 公開（公告）號: CN102286515A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 周江寧;方輝;趙君
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/63
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 逯長明

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體的說是涉及一種構建T載體的方法。

背景技術

基因克隆技術是現代基因工程研究的一項基本技術，是研究基因結構與功能的前提，利用T載體進行基因克隆是其中一種最簡捷、方便的方法。T載體是聚合酶鏈反應產物的克隆用載體，線性化后兩側3′端各多出一個脫氧胸苷酸(T)。

在利用Taq?DNA聚合酶對基因進行PCR擴增時，PCR產物的3′末端會多加上一個脫氧腺苷酸(A)堿基，可與T載體的3′末端突出的T堿基配對，在DNA連接酶的作用下形成閉合環狀分子，然后轉化入大腸桿菌感受細胞，培養長成克隆菌落。利用菌落PCR和抽提質粒后限制性酶切的方法來初步篩選陽性克隆，最后通過測序來鑒定克隆到的基因片段是否是目的基因片段。PCR產物與T載體之間的A-T互補性可提高PCR產物克隆的效率，因此T載體在基因克隆方面應用非常廣泛。

目前T載體售價大多偏高，而且存在連接效率低、連接不穩定等缺陷。因此制備高質量、穩定、價廉的T載體是廣大分子生物學研究者關心的問題，也是生物試劑廠商感興趣的業務之一。

目前T載體的構建方法主要是用產生平末端的限制性內切酶(如EcoRV)將質粒DNA切開，利用Taq?DNA聚合酶和ddTTP在線性質粒兩條鏈的3′端加T制成T載體，如Takara的pMD系列T載體和Promega的pGEM系列T載體。但該方法存在兩方面的缺陷：一是線性質粒3′末端在DNA聚合酶作用下加T可能不完全，造成克隆過程中自身環化率高，假陽性率較高；二是該方法需要經過EcoRV酶切、DNA聚合酶加T、電泳凝膠回收DNA片段等多個步驟，需要進行質量控制的環節較多，影響T載體克隆效率的因素也很多，T載體質量較低。同時由于T載體的生產過程繁瑣，成本較高，最終導致商業化T載體的價格較高。

發明內容

有鑒于此，本發明目的是提供一種簡便高效構建T載體的方法，利用該方法可獲得高質量、高穩定性的T載體，其克隆效率和正確率高。

為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：

一種構建T載體的方法，包括：

步驟1、將兩端含有特異限制性內切酶識別序列的抗性基因定向克隆到出發載體的兩個多克隆位點之間，用上述抗性基因對應的抗生素篩選陽性克隆，得到T載體前體；

步驟2、用步驟1所述特異限制性內切酶識別序列對應的特異限制性內切酶消化步驟1所得T載體前體，回收大片段，得到T載體；

其中，所述特異限制性內切酶為其識別序列被酶切后突出末端位點可以是T的限制性內切酶，步驟1所述抗性基因與出發載體所含抗性基因不同。

本發明所述構建T載體的方法是利用限制性酶切法原理，將兩端含有特異限制性內切酶識別序列的抗性基因定向克隆到出發載體上，在出發載體質粒的多克隆位點引入酶切后突出末端位點可以是T的限制性內切酶酶切位點和與出發載體所含抗性基因不同的抗性基因的片段，用上述抗性基因對應的抗生素篩選陽性克隆，得到T載體前體，然后用特異限制性內切酶識別序列對應的特異限制性內切酶酶切消化產生3′端具有單個突出T的線性T載體。

由限制性內切酶酶切產生的T載體具有酶切產量高、質量穩定、易于操作等特點，然而由于定向克隆到出發載體中經常會發生出發載體環化現象，造成假陽性。為了提高克隆效率，減少假陽性，需要把陽性克隆從部分假陽性中分離出來。本發明在構建T載體前體質粒時引入與出發載體所含抗性基因不同的抗性基因進行篩選，以便能很容易區分陽性克隆，方法簡便高效，可操作性高。

優選的，本發明所述構建T載體的方法，步驟1具體包括：

步驟1a、以含有抗性基因的載體為模板，利用上游引物和下游引物擴增抗性基因片段，回收抗性基因片段備用，其中，所述上游引物和下游引物均含有一個特異限制性內切酶識別序列和一個出發載體中具有的限制性內切酶的識別序列，限制性內切酶的識別序列位于特異限制性內切酶識別序列的5′端，且上游引物和下游引物含有的限制性內切酶的識別序列不同；

步驟1b、分別利用識別步驟1a所述限制性內切酶識別序列的限制性內切酶消化出發載體和步驟1a所得抗性基因片段；

步驟1c：回收線性化出發載體和消化后抗性基因片段，混合，在T4?DNA連接酶作用下連接，用上述抗性基因對應的抗生素篩選陽性克隆，得到T載體前體。