[發明專利]一種構建T載體的方法

無效

• 申請號: 201110177458.0
• 申請日: 2011-06-28
• 公開（公告）號: CN102286515A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 周江寧;方輝;趙君
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/63
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 逯長明

1.一種構建T載體的方法，其特征在于，包括：

步驟1、將兩端含有特異限制性內切酶識別序列的抗性基因定向克隆到出發載體的兩個多克隆位點之間，用上述抗性基因對應的抗生素篩選陽性克隆，得到T載體前體；

步驟2、用步驟1所述特異限制性內切酶識別序列對應的特異限制性內切酶消化步驟1所得T載體前體，回收大片段，得到T載體；

其中，所述特異限制性內切酶為其識別序列被酶切后突出末端位點可以是T的限制性內切酶，步驟1所述抗性基因與出發載體所含抗性基因不同。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟1具體包括：

步驟1a、以含有抗性基因的載體為模板，利用上游引物和下游引物擴增抗性基因片段，回收抗性基因片段備用，其中，所述上游引物和下游引物均含有一個特異限制性內切酶識別序列和一個出發載體中具有的限制性內切酶的識別序列，限制性內切酶的識別序列位于特異限制性內切酶識別序列的5′端，且上游引物和下游引物含有的限制性內切酶的識別序列不同；

步驟1b、分別利用識別步驟1a所述限制性內切酶識別序列的限制性內切酶消化出發載體和步驟1a所得抗性基因片段；

步驟1c：回收線性化消化后出發載體和抗性基因片段，混合，在T4?DNA連接酶作用下連接，用上述抗性基因對應的抗生素篩選陽性克隆，得到T載體前體。

3.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟1所述特異限制性內切酶為AhdI、BmrI、HPyAV、MnlI、BciVI、HphI、MboII、XcmI、Bst4CI、TaaI、Tsp4CI、AspEI、BmeRI、Hpy188I或HpyCH4III。

4.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟1所述出發載體為pUC18或pUC19。

5.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述抗性基因為具有SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列的卡那霉素抗性基因。

6.根據權利要求5所述方法，其特征在于，步驟1a所述含有抗性基因的載體為pEGFP-C1載體。

7.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟1a所述上游引物含有的限制性內切酶識別序列為BamHI的識別序列，下游引物含有的限制性內切酶識別序列為HindIII的識別序列。

8.根據權利要求2所述方法，其特征在于，在步驟1a所述限制性內切酶的識別序列5′端還分別含有1～6個堿基的保護序列。

9.根據權利要求8所述方法，其特征在于，步驟1a所述上游引物為SEQ?ID?NO：2所示核苷酸序列，步驟1a所述下游引物為SEQ?ID?NO：3所示核苷酸序列。

10.權利要求1～9任意一項所述方法制備的T載體。