[發(fā)明專利]鴨瘟病毒 gG截段重組蛋白及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110177128.1
• 申請日: 2011-06-28
• 公開（公告）號: CN102250224A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程安春;楊曉圓;汪銘書;陳孝躍
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物工程技術(shù)中心
• 主分類號: C07K14/03
• 分類號: C07K14/03;C07K1/22;C12N15/38;C12N15/70
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及鴨瘟病毒抗體的試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

鴨瘟(Duck?Plague,DP)是由皰疹病毒科中的鴨瘟病毒(Duck?plague?virus,DPV)引起的鴨、鵝和天鵝等水禽的一種急性、熱性、接觸性傳染的敗血性傳染病。該病可導(dǎo)致商品水禽產(chǎn)蛋量下降及死亡，對野生水禽也有不同的致死率。DP的臨床表現(xiàn)為精神沉郁，高熱稽留，兩腿麻痹、下痢、流淚，部分病鴨頭頸腫大,是一種廣泛嗜全身性感染的傳染病，臨床以急性敗血癥過程為特征；病理剖解特征是血管損傷，組織器官出血，消化道出血、炎癥和壞死，消化道粘膜某些特定部位有疹狀損害，淋巴器官受損以及實質(zhì)器官的退行性變化，其發(fā)病率和死亡率都甚高。近年來，隨著養(yǎng)鴨業(yè)生產(chǎn)向集約化、規(guī)模化的方向發(fā)展，鴨瘟作為威脅養(yǎng)鴨業(yè)最嚴重的接觸性傳染病之一，造成了巨大的經(jīng)濟損失。

過去對鴨瘟病毒血清抗體的檢測方法主要是利用全病毒作為抗原進行檢測，但傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法大約需要4～5天，方法繁瑣，費時費力，且純化后的病毒中會摻雜有許多宿主細胞成分，導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供一種鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白，該蛋白能作為鴨瘟病毒抗體的捕獲劑。

為實現(xiàn)上述方案，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

所述的鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白的DNA序列如SEQ?ID?NO:2?所示。

本發(fā)明的目的之二在于提供鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白的制備方法，該方法可用于鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白大規(guī)模生產(chǎn)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

所述的鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白的制備方法，具體包括以下步驟：

A、以DPV基因組DNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的上、下游引物PCR擴增得鴨瘟病毒?gG截段基因片段，與pMD18-T?的連接，得pMD18-gGM;

B、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ分別雙酶切pMD18-gGM質(zhì)粒和原核表達載體pET32a(+),并連接,?得重組原核表達質(zhì)粒pET32a-gGM;

C、并將上述提取的重組質(zhì)粒pET32a-gGM轉(zhuǎn)化到表達宿主菌誘導(dǎo)表達,得鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白粗品。

進一步，將步驟C所得鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白粗品經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化后，得鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白；

進一步，步驟C中的宿主菌為菌株BL21(DE3)，在IPTG濃度≥0.2mmol/L,誘導(dǎo)溫度為30℃條件下進行誘導(dǎo)表達2小時，得鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白。

本發(fā)明的有益效果在于：鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白是選取鴨瘟病毒（DPV）gG基因編碼蛋白的主要抗原域（68aa-377aa），并命名為gGM；然后利用基因工程技術(shù)，將其進行克隆的基礎(chǔ)上，將其與原核表達載體pET-32a(+)連接，成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)表達系統(tǒng)進行誘導(dǎo)、表達的基因工程產(chǎn)品。該蛋白的表達形式是gGM/His融合蛋白，表達的融合蛋白分子量為50kDa，將產(chǎn)品設(shè)計為融合表達一是考慮便于純化，二是能增加表達蛋白的免疫原性。經(jīng)原核表達系統(tǒng)表達后的產(chǎn)品經(jīng)Western?blot進行鑒定后表面具有與天然蛋白相似的免疫反應(yīng)活性。

采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品可用于：

①?本產(chǎn)品可作為檢測鴨瘟病毒抗體的間接ELISA方法的檢測抗原。

②?可作為預(yù)防鴨瘟病毒感染的基因工程亞單位疫苗。

本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)點體現(xiàn)在：

①?由于該檢測抗原是鴨瘟病毒?gG截段重組蛋白，并非全病毒，以此應(yīng)用該檢測抗原進行檢測時無散毒危險。

②?作為ELISA抗原檢測鴨瘟病毒抗體，特異性強，無交叉反應(yīng)。

③?性能穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低，適合工廠化生產(chǎn)，市場應(yīng)用前景廣。

更多有益效果，將在實施例中體現(xiàn)。

圖1為gG截段基因的PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中1為gG截段基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的特異性DNA條帶，M為DNA?Marker。

????圖2為重組質(zhì)粒pMD18-gGM的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M為DNA?Marker，1為重組質(zhì)粒pMD18-gGM?用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的兩條特異性條帶。