[發明專利]臍帶間充質干細胞數字化自動生產方法

有效

• 申請號: 201110176693.6
• 申請日: 2011-06-28
• 公開（公告）號: CN102250837A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 楊兵;李偉
• 申請（專利權）人: 江蘇省北科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種臍帶間充質干細胞數字化自動生產方法，包括以下步驟：

(1)將無菌采集的臍帶剪成1mm³的組織塊，組織塊經培養液重懸后經第一培養瓶的組織塊添加接口A2加入，然后關閉組織塊添加接口A2，系統進入細胞培養狀態，生物反應器的探測裝置對培養過程的各項參數進行探測；

(2)生物反應器控制供氣裝置使細胞生長過程中CO₂的濃度始終保持在5%，并保持培養瓶氣壓恒定；當培養液中營養物質消耗過多，生物反應器和機械流水線協同操作換液如下：第一培養瓶即原代組織塊培養瓶受控振蕩10秒鐘后翻轉倒置，培養液由去液接口A3排除，第一培養瓶受控翻轉正置，經加液接口A1補充新的培養液；

(3)機械流水線保持第一培養瓶中細胞培養溫度37℃恒定，并定期微小振蕩，保證原代細胞貼壁均一；

(4)生物反應器的探測裝置通過探測各項關鍵參數變化趨勢，分析、判斷出第一培養瓶中的細胞生長狀況，并計算出細胞傳代的時間，細胞消化所需的各種液體的量；

(5)至細胞傳代時，第一培養瓶受控翻轉倒置，培養液由去液接口A3排除，第一培養瓶受控翻轉正置，經加液接口A1補充生理鹽水，機械流水線振蕩使第一培養瓶洗滌10秒鐘，第一培養瓶受控翻轉倒置，生理鹽水由去液接口A3排除，第一培養瓶受控翻轉正置，再經加液接口A1補充細胞消化所需的酶，機械流水線振蕩培養瓶37℃消化5分鐘，第一培養瓶受控翻轉呈90度豎直，使細胞懸液經收集接口A4轉移至第二培養瓶的細胞添加接口B2，第一培養瓶受控翻轉正置，再經加液接口A1補充少量培養液，機械流水線振蕩培養瓶10秒鐘，第一培養瓶受控翻轉呈90度豎直，使殘留細胞懸液經收集接口A4轉移至第二培養瓶的細胞添加接口B2；

(6)第一培養瓶受控復位，經加液接口A1補充培養液，瓶中原代組織塊繼續培養；

(7)第二培養瓶受控側翻90度后迅速正置以保證各細胞培養層液體分布均勻，靜置培養12小時使細胞貼壁，第二培養瓶受控側翻90度后停留5秒鐘后緩慢倒置，培養液經去液接口B3排除，第二培養瓶受控翻轉正置，生理鹽水經加液接口B1加入，第二培養瓶受控側翻90度后迅速正置，機械流水線振蕩洗滌10秒鐘，第二培養瓶受控側翻90度后停留5秒鐘后緩慢倒置，生理鹽水由去液接口B3排除，第二培養瓶受控翻轉正置，經加液接口B1補加新的培養液，第二培養瓶受控側翻90度后迅速正置后靜置培養；探測裝置通過探測各項關鍵參數變化趨勢，分析、判斷出第二培養瓶中細胞生長狀況，并計算出細胞傳代的時間和細胞消化所需的各種液體的量；

(8)至細胞傳代時，第二培養瓶受控側翻90度后停留5秒鐘后緩慢倒置，培養液由去液接口B3排除，培養瓶受控翻轉正置，經加液接口B1補充生理鹽水，第二培養瓶受控側翻90度后迅速正置，機械流水線振蕩培養瓶洗滌10秒鐘，培養瓶受控側翻90度后停留5秒鐘后緩慢倒置，生理鹽水由去液接口B3排除，培養瓶受控翻轉正置，再經加液接口B1補充細胞消化所需的酶，第二培養瓶受控側翻90度后迅速正置，機械流水線振蕩培養瓶37℃消化5分鐘，?培養瓶受控翻轉呈90度豎直狀態，使細胞懸液經收集接口B4轉移至第三培養瓶的細胞添加接口C2，第二培養瓶受控翻轉正置，再經加液接口B1補充少量培養液，第二培養瓶受控側翻90度后迅速正置，機械流水線振蕩培養瓶10秒鐘，第二培養瓶受控翻轉呈90度豎直狀態，使殘留細胞懸液經收集接口B4轉移至第三培養瓶的細胞添加接口C2；

(9)第二培養瓶受控復位，等待從第一培養瓶中消化的細胞再次移入培養；

(10)第三培養瓶受控側翻90度后迅速正置以保證各細胞培養層液體分布均勻，靜置培養12小時使細胞貼壁，第三培養瓶受控側翻90度后停留5秒鐘后緩慢倒置，培養液經去液接口C3排除，第三培養瓶受控翻轉正置，生理鹽水經加液接口C1加入，第三培養瓶受控側翻90度后迅速正置，機械流水線振蕩洗滌10秒鐘，第三培養瓶受控側翻90度后停留5秒鐘后緩慢倒置，生理鹽水由去液接口C3排除，第三培養瓶受控翻轉正置，經加液接口C1補加新的培養液，第三培養瓶受控側翻90度后迅速正置后靜置培養；探測裝置通過探測各項關鍵參數變化趨勢，分析、判斷出第三培養瓶中細胞生長狀況，并計算出細胞傳代的時間和細胞消化所需的各種液體的量；

(11)細胞傳代時，第三培養瓶受控側翻90度后停留5秒鐘后緩慢倒置，培養液由去液接口C3排除，培養瓶受控翻轉正置，經加液接口C1補充生理鹽水，第三培養瓶受控側翻90度后迅速正置，機械流水線振蕩培養瓶洗滌10秒鐘，培養瓶受控側翻90度后停留5秒鐘后緩慢倒置，生理鹽水由去液接口C3排除，培養瓶受控翻轉正置，再經加液接口C1補充細胞消化所需的酶，第三培養瓶受控側翻90度后迅速正置，機械流水線振蕩培養瓶37℃消化5分鐘，?培養瓶受控翻轉呈90度豎直狀態，使細胞懸液經收集接口C4轉移至細胞收集容器中，第三培養瓶受控翻轉正置，再經加液接口C1補充少量培養液，第三培養瓶受控側翻90度后迅速正置，機械流水線振蕩培養瓶10秒鐘，第三培養瓶受控側翻90度后停留5秒鐘后緩慢倒置，使殘留細胞懸液經收集接口C4轉移至細胞收集容器中；

(12)從第一培養瓶中長出的細胞，重復上述步驟(2)-(11)操作3次后，此來源的臍帶間充質干細胞培養的操作結束；

(13)細胞收集容器中收集的細胞經簡單的洗滌即可得到臨床用的臍帶間充質干細胞。