[發明專利]一種從血漿分離組分Ⅰ+Ⅲ中純化人免疫球蛋白的方法

有效

• 申請號: 201110174857.1
• 申請日: 2011-06-27
• 公開（公告）號: CN102250240A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 馬山;邵玉娟;師秀梅;菅長永;李斌;高亞朋;高建鋒;高超;鞏艷艷;朱孟沼
• 申請（專利權）人: 山東泰邦生物制品有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 辛向東

技術領域

本發明屬于生物制藥血液制品領域，具體涉及一種用正辛酸沉淀結合一步陰離子交換層析技術從血漿生產廢棄組分Ⅰ+Ⅲ中分離純化人免疫球蛋白的方法。

背景技術

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是人體對外來抗原（如細菌、病毒及其它毒素或異物）進行免疫應答的主要物質。血漿來源的人免疫球蛋白制品按注射途徑分為：靜脈注射人免疫球蛋白（Intravenous?Immunoglobulin?G，IVIG）和肌肉注射人免疫球蛋白，其主要成分為免疫球蛋白G（IgG），它是最重要的血漿蛋白之一，分子量150kDa，在血漿中的含量大概是6.6~14.5g/L。自20世紀80年代問世以來，已經成功用于免疫缺陷造成的感染性疾病的預防，治療原發性免疫缺陷、感染性疾病、獲得性免疫缺陷等疾病。

目前人免疫球蛋白的獲取主要是從血漿及相關組分Ⅱ中純化制備，由于原料血漿來源有限，人血漿來源的免疫球蛋白供不應求，同時由于原料的特殊性（為寶貴的人血）以及嚴格的血漿篩選（對混合血漿進行病毒抗體、特異性抗原及核酸的篩查）都使得血漿蛋白產品價格變得非常昂貴。

綜上，目前人免疫球蛋白的制備主要存在以下問題：

1、目前國內外人免疫球蛋白的獲取主要是從低溫乙醇沉淀組分Ⅱ制備，經過純化得到人免疫球蛋白。提取人免疫球蛋白后會產生組分Ⅰ+Ⅲ沉淀，被作為廢物處理，鮮有從組分Ⅰ+Ⅲ中純化人免疫球蛋白的制備方法。這主要是因為組分Ⅰ+Ⅲ中成分復雜，其主要成分有脂蛋白、纖維蛋白原、纖維結合蛋白、IgG、IgM、凝血因子Ⅷ等，同時也含有各種微量的其他蛋白，如IgA、凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、銅藍蛋白等。組分Ⅰ+Ⅲ中的各類凝血因子，極容易在分離過程中活化，從而造成分離過程中成分不穩定，產生大量的沉淀或絮狀。組分Ⅰ+Ⅲ中的脂蛋白也是難以徹底去除的物質，脂蛋白的殘留將影響產品過濾以及后續步驟中所使用凝膠的壽命。將組分Ⅰ+Ⅲ溶解液進行非還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）（見圖2），可見組分Ⅰ+Ⅲ沉淀中蛋白質成分至少有十種之多，用Gel-Pro?analyzer軟件對各類條帶進行面積積分分析，結果IgG含量20~30%，同時進行高效液相色譜法（HPLC）分析（見圖3），IgG含量22.39%，其他各類雜蛋白含量有75%以上。從雜質含量占75%以上的組分Ⅰ+Ⅲ中提取適合臨床使用的人免疫球蛋白，相對于從IgG含量超過70%的組分Ⅱ+Ⅲ或Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ中純化人免疫球蛋白則難度大很多。

2、國內有通過低溫乙醇法從組分Ⅰ+Ⅲ或組分Ⅲ中提取人免疫球蛋白，從而提高收率的方法。例如呂勇等（CN?101648998A）利用低溫乙醇法，將組分Ⅰ+Ⅲ沉淀溶解后，用8~9%乙醇沉淀壓濾組分Ⅰ后，再用13-15%乙醇沉淀壓濾組分Ⅲ，最后用17~19%乙醇沉淀分離組分Ⅱ，最后將組分Ⅱ溶解、超濾、純化、配制獲得免疫球蛋白制品，其產品符合《中國藥典》（三部）的要求。但是此工藝采用三次低溫乙醇沉淀法從組分Ⅰ+Ⅲ中提純人免疫球蛋白，步驟繁多，同時在組分Ⅰ+Ⅲ中仍采取低溫乙醇法分離免疫球蛋白，收率低，生產環境要求低溫，能耗較高。乙醇類的化學物質容易破壞IgG的生物學功能，用該方法制備的IgG容易形成聚集體。該工藝需將組分Ⅱ通過加溫至51-53℃?3小時進行提純，由于免疫球蛋白的耐熱性與其純度有關，一般純度越高，其耐熱性就越差，因此該方法也不能最大程度的保留人免疫球蛋白天然的理化性質和生物學活性。同時，由于組分Ⅲ為血漿分離中病毒較為集中的組分，因此病毒滅活顯得尤為重要，而該工藝只采用一種病毒滅活方式，尚不能完全滅活/去除病毒。

3、層析法近年來越來越廣泛的應用于血漿蛋白的分離純化，在人免疫球蛋白的制備中，應用較多的是離子交換層析法，但多采用陽離子與陰離子結合或兩步陰離子交換柱層析，否則純化效果難于達到要求。

4、用辛酸或辛酸鹽沉淀非IgG類雜蛋白來達到分離IgG的技術尚不成熟，目前處于研究階段，國內外還未見用辛酸沉淀組分Ⅰ+Ⅲ進行純化免疫球蛋白的報道。因此，研究開發辛酸沉淀法提高人免疫球蛋白分離制備過程中的收率，特別是從血漿分離組分廢棄物FⅠ+Ⅲ中回收IgG，對于增加市場供應、緩解國內血漿供應緊張的局面具有極大的現實意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從血漿生產廢棄組分Ⅰ+Ⅲ中高效率的回收高純度的人免疫球蛋白的方法，該方法用辛酸沉淀組分Ⅰ+Ⅲ中的非IgG雜蛋白、結合一步陰離子交換層析技術，分離純化人免疫球蛋白IgG。