[發明專利]一種甲胎蛋白的均相時間分辨熒光分析方法

有效

• 申請號: 201110174552.0
• 申請日: 2011-06-25
• 公開（公告）號: CN102353790A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 劉天才;李明;吳英松
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所 44244
• 代理人: 胡濟元

技術領域

本發明屬于生物分析化學、納米生物技術領域，具體涉及生物物質的免疫測定法。

背景技術

人體甲胎蛋白(AFP)來源于胎兒的糖蛋白，分子量約為70KDa，成人的甲胎蛋白可由惡性腫瘤產生，特別是肝癌和胚胎細胞腫瘤，70-95％的原發性肝癌患者血清中AFP含量有明顯升高，在肝炎和肝硬化的患者中甲胎蛋白也常有輕微的升高。

因此，對AFP的臨床分子診斷顯得十分重要，其中的最低靈敏度檢測對及早發現腫瘤并制定治療方案尤為重要。目前，測定AFP免疫檢測方法較多，最常用的血清檢測方法有：酶免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)、化學發光法以及時間分辨免疫熒光分析法(TRFIA)。其中，酶標法為半定量試劑，在準確性、靈敏度上存在很大的局限性，并且對于酶的活性極易受標記反應以及溫度、pH值及溶液中離子濃度等因素的影響、線性范圍窄、費事等缺點；放射性免疫法操作帶放射性以及標志物放置時間短，試劑有效期較短等缺點；化學發光法的優點是靈敏度高、線性范圍寬、分析時間短，但它的缺點：化學發光的產生通常是瞬間完成的，發光峰值很快衰減，而且成本較高；溫度和pH值對發光有很大影響等，這些因素影響了該類方法的進一步使用。TRFIA以稀土離子作為標記物，具有制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、重復性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應用范圍十分廣泛等優點；但是，因為需要沖洗未標記物，操作較為繁瑣，很難高通量化和微量化。

這些方法為非均相分析方法，雖然其檢測性能也都能滿足臨床要求，但靈敏度相對依然較低。非均相分析方法一般是在一個固定的平臺上反應，然后，通過沖洗的方法將游離而未參與免疫反應的標記物除去，然后檢測剩余的有效標記物。伴有沖洗的方法，不僅可能破壞有效標記物，而致使靈敏度不高，不僅費事，操作也較為繁瑣，很難高通量化、自動化和微量化。

而均相時間分辨熒光分析就可以克服這些缺點，分析操作簡單，不需要洗滌分離游離標記物，分析速度快，易自動化等優點，在生物分析領域其應用越來越廣泛。

現有均相時間分辨熒光分析(HTRFA)技術，能量供體與受體是一對一的分子相互作用形成能量轉移，從而實現定性定量分析。其技術難題在于：一對一的分子能量共振能量轉移(FRET)效率很低，供體的能量不能充分利用，其靈敏度受到一定的限制。導致FRET效率低下還有一個原因就是，目前這些分析方法用到的能量受體是熒光素(fluorescein)、青色素(cyanine，cy)，亞歷克撒染料(Alexa)，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)或別藻紅蛋白(allophycocyanin，APC)等有機染料。盡管有機染料已使用數十載，然而，眾所周知，有機染料致命的缺點就是光譜的Stock位移比較短，熒光發射峰不對稱且有明顯拖尾，最致命的是抗光漂白性極差，使得基于熒光值分析測試方法的生物分析，尤其是HTRFA很不穩定，效率低下，間內和間外分析偏差較大。因此，有機染料并非HTRFA能量受體的最佳選擇。另一方面，現有HTRFA技術得以實現歸功于稀土金屬螯合物的使用，一般的能量供體是稀土金屬銪螯合物，要求能量受體發射近紅外波(比如665nm)，這需要昂貴的近紅外敏感檢測器件。即使使用鋱螯合物，由于大多數有機染料熒光發射光譜寬而且有明顯拖尾，與鋱螯合物時間分辨熒光譜有較大重疊，僅適合在長波長或近紅外波段進行分析，對昂貴的近紅外敏感檢測器要求依然存在。

因此，為彌補現有技術的不足，需改變現有技術能量配體一對一的方式，采用一個能量供體同時向數個能量受體同時進行時間分辨能量轉移。更需要尋求一種具有新奇的光學特性的能量受體：其光譜的Stock位移比較寬，熒光發射峰對稱且無明顯拖尾，更重要的是抗光漂白性極強，而且該能量受體不依賴于昂貴的紅敏檢測器。

發明內容

鑒于現有技術的不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種甲胎蛋白的均相時間分辨熒光分析方法，該方法特異性強和檢測靈敏度高。

本發明解決上述問題采用的技術方案是，

一種甲胎蛋白的均相時間分辨熒光分析方法，該方法由以下步驟組成：

(a)定量標準曲線制備：將HFRFA能量受體、HFRFA能量供體和甲胎蛋白標準品一起孵育，進行均相時間分辨熒光檢測和分析，得到甲胎蛋白濃度與熒光值的標準曲線；

(b)樣品檢測：將HFRFA能量受體、HFRFA能量供體和待測甲胎蛋白樣品一起孵育，進行均相時間分辨熒光檢測和分析，將檢測樣品得到的熒光值與步驟(a)得到的標準曲線比較計算待測甲胎蛋白樣品濃度；

其中，