[發明專利]一種通過同源重組敲除manX的高產氨基葡萄糖工程菌及其構建方法

有效

• 申請號: 201110174246.7
• 申請日: 2011-06-27
• 公開（公告）號: CN102286420A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;劉龍;李江華;陳欣;何菊
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/52;C12N15/60;C12N15/63;C12N15/09;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及一種產氨基葡萄糖基因工程菌及其構建方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

氨基葡萄糖(Glucosamine，2-amino-2-deoxy-D-glucose)是葡萄糖的一個羥基被氨基取代后的化合物。幾乎存在與所有有機體中，包括細菌、酵母、絲狀真菌、植物以及動物體，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要組成成分。氨基葡萄糖能特異性地作用于關節軟骨，恢復軟骨細胞正常的代謝功能，能刺激軟骨細胞產生具有正常多聚體結構的蛋白多糖，抑制損傷軟骨的酶，延緩骨性關節炎的病理過程和疾病的進展，改善關節活動，緩解疼痛。因此，臨床上多用于治療骨關節炎。此外，氨基葡萄糖還具有肝腎解毒，發揮抗炎、護肝的作用；刺激嬰兒腸道中雙歧桿菌的增生；在醫藥上作為抗菌消炎藥物，用于治療風濕性關節炎和胃潰瘍疾病。在食品中，是嬰兒配方乳中添加的一種重要微量糖類成分，還是合成VB6和核黃素中間體的起始原料，此外也可用于化妝品和飼料添加劑中。

甲殼素水解法是我國目前生產氨基葡萄糖的主要方法，甲殼素水解法轉化效率低，產生大量酸性廢水，因而產品成本高、污染嚴重。目前，國內外對生物法生產氨基葡萄糖的報道較少，發酵產量也較低，尚未達到工業化生產的要求。

在發酵過程中當碳源葡萄糖濃度較低時，氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖可以被細胞當作碳源利用。氨基葡萄糖依靠甘露糖磷酸轉移系統(mannose?PTS，II^Man，由manXYZ操縱子編碼)和葡萄糖磷酸轉移系統(glucose?PTS，II^Glc，由pstG基因編碼)對其進行磷酸化后從胞外向胞內轉運，而N-乙酰氨基葡萄糖在從胞外向胞內轉運時，依靠II^Man和乙酰氨基葡萄糖磷酸轉移系統(GlcNAc?PTS，II^NAG，由基因nagE編碼)對其進行磷酸化后進行轉運。因此，要想在胞外積累高濃度的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖，就必須對其轉運途徑進行阻斷，減弱氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖從胞外到胞內的轉運。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種高產氨基葡萄糖基因工程菌，所述重組菌為是克隆E.coli?BL21(DE3)基因組中氨基葡萄糖合成酶glmS基因和釀酒酵母S.cerevisiae?S288C基因組中氨基葡萄糖乙酰化酶gna1基因，同時敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸轉運系統nagE基因和甘露糖磷酸轉移系統manX基因構建而成的重組大腸桿菌。

所述氨基葡萄糖合成酶的基因來源于GenBank?No.CP001509.3基因組中glmS片斷，氨基葡萄糖乙酰化酶gna1基因來源于GenBank?NC_001138，大腸桿菌為E.coli?K-12(ATCC25947)。

將氨基葡萄糖合成酶編碼基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因gna1連接到載體pET-28a(+)上。

本發明還提供了一種構建高產氨基葡萄糖基因工程菌的方法，用限制性內切酶Sac?I和Hind?Ⅲ對glmS基因片斷和pET-28a(+)進行酶切，并通過連接反應將glmS基因片斷插入質粒pET-28a(+)的Sac?I和Hind?Ⅲ位點之間；用限制性內切酶Not?I和Xho?I對gna1基因片斷和pET-28a(+)進行酶切，并通過連接反應將gna1基因片斷插入質粒pET-28a(+)的Not?I和Xho?I位點之間得到重組質粒pET-28a(+)-glmS-gna1。敲除E.coli?ATCC?25947基因組中nagE和manX基因片段，得到nagE和manX基因失活的菌株E.coli-ΔnagE-ΔmanX，再將攜帶有glmS和gna1基因片段的質粒pET-28a(+)-glmS-gna1轉化大腸桿菌E.coli-ΔnagE-ΔmanX中得到重組菌E.coli-glmS-gna1-ΔnagE-ΔmanX。

所述重組菌培養環境條件：

培養時間為12h，溫度37℃，搖床轉速200rpm，待OD₆₀₀達到0.6時，按照10％濃度加入乳糖(使發酵液中終濃度為5g/L)誘導glmS和gna1基因的表達。

所述重組菌培養基組成為：

種子培養基：蛋白胨12g，酵母膏24g，甘油4ml，按照50μg/ml加入卡那霉素，pH自然。；

發酵培養基：蛋白胨12g，酵母膏24g，葡萄糖10g，按照50μg/ml加入卡那霉素，pH自然。