[發(fā)明專利]一種甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110172722.1
• 申請(qǐng)日: 2011-06-24
• 公開（公告）號(hào): CN102230018A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈萬寬;劉睿;楊湛端;鄧海華;陳健文;陳仲華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州甘蔗糖業(yè)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種病菌的快速檢測(cè)方法，特別涉及甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

由木質(zhì)部賴氏小桿菌（Leifsonia?xyli?subsp.?Xyli,Lxx）引起的甘蔗宿根矮化病是一種世界性重要甘蔗病害，也是我國一種經(jīng)濟(jì)危害性較嚴(yán)重的甘蔗病害。其主要傳播途徑是帶病（菌）種苗（莖）傳播。種植甘蔗脫毒（菌）種苗是防治甘蔗宿根矮化病的重要途徑，建立準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高的甘蔗宿根矮化病菌快速檢測(cè)方法，是甘蔗脫毒（菌）種苗生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一。

目前檢測(cè)甘蔗宿根矮化病菌的方法有剖莖檢測(cè)法，相差顯微鏡檢測(cè)法，免疫學(xué)，PCR。但甘蔗宿根矮化病早期沒有明顯的外部癥狀、內(nèi)部癥狀，所以剖莖檢測(cè)法和相差顯微鏡檢測(cè)診斷可靠性差；而病原菌細(xì)小且極難培養(yǎng)，免疫學(xué)方法準(zhǔn)確率不高，靈敏度差，還會(huì)出現(xiàn)假陽性；目前應(yīng)用于甘蔗宿根矮化病的PCR檢測(cè)技術(shù)，首先是提取DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，普遍認(rèn)為提高了檢測(cè)的靈敏度，但是該技術(shù)還不夠成熟，尤其檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性差。基于上述方法存在的不足，本發(fā)明自行設(shè)計(jì)引物，采用巢式PCR對(duì)甘蔗宿根矮化病菌進(jìn)行檢測(cè)，這樣即使樣本DNA量很少或質(zhì)量不高的情況下也可以擴(kuò)增出應(yīng)有的產(chǎn)物，國內(nèi)外均未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速檢測(cè)方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速檢測(cè)方法，包括如下步驟：

1)??????提取待檢樣品的全DNA；

2)??????以得到的全DNA為模板，以ITS1：5’–?AGTCGTAACAAGGTAGCCGT?-3’?（SEQ?ID?NO.1）和ITS2：5’–?GTGCCAAGGCATCCACC?-3’?（SEQ?ID?NO.2）為引物，進(jìn)行首輪PCR，得到首輪PCR產(chǎn)物；

3)??????以上述PCR產(chǎn)物為模板，以RL2：5’?–GAGACAGTACTTATCACTTCGG-3’?（SEQ?ID?NO.3）和RR2：5’–?CGACGCAGATTGACCAATGATC?-3’?（SEQ?ID?NO.4）為引物，進(jìn)行二輪PCR；

4)??????對(duì)二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)371?bp目的片斷的有無，判斷樣品為陽性或者陰性。

優(yōu)選的，首輪PCR的反應(yīng)體系為：全DNA?1μl（10-100?ng），5U/μl的?Taq酶0.2μl，10×含Mg²⁺?PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，各dNTPs均為2.5?mmol/L的混合液2μl，5μmol/L的ITS1/ITS2引物各1μl，滅菌超純水補(bǔ)足至25μl。

優(yōu)選的，首輪PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃?5min；94℃?30s，56℃?40s，72℃?1min；循環(huán)30次；72℃?10min,4℃?保存。

優(yōu)選的，二輪PCR的反應(yīng)體系為：1μl首輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或其10倍稀釋液，5μmol/L的引物RL2/RR2各1μl，10×含Mg²⁺?PCR反應(yīng)緩沖液2.0?μl，各dNTPs均為2.5?mmol/L的混合液1.6μl，5U/μl的?Taq酶0.2μl，滅菌超純水補(bǔ)足至20μl。

優(yōu)選的，二輪PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35-40個(gè)循環(huán)；72℃擴(kuò)增5min，4℃?保存。

本發(fā)明檢測(cè)方法靈敏度極高，其最低檢測(cè)限量不超過100?fg甘蔗宿根矮化病菌Lxx基因組DNA，是常規(guī)PCR最低檢測(cè)限量的1/100～1/1000，即本發(fā)明建立的甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR檢測(cè)靈敏度較常規(guī)PCR檢測(cè)靈敏度提高100至1000倍。

本發(fā)明檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，對(duì)甘蔗白條病葉組織、水稻基腐病菌、水稻白葉枯病菌及甘蔗健康葉片基因組總DNA無擴(kuò)增產(chǎn)物；而對(duì)甘蔗宿根矮化病菌基因組DNA能擴(kuò)增出大小為371?bp的單一目的條帶。

本發(fā)明檢測(cè)方法快速，從葉片樣品DNA的提取、PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)，一般一天可完成檢測(cè)。

本發(fā)明檢測(cè)方法適用于甘蔗引種檢疫、甘蔗脫毒（菌）種苗質(zhì)量檢測(cè)及蔗區(qū)宿根矮化病診斷與普查等。

附圖說明

圖1是甘蔗樣品宿根矮化病菌巢式PCR檢測(cè)結(jié)果；

圖2是巢式PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果；?

圖3是巢式PCR特異性擴(kuò)增檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式