[發明專利]一種甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速檢測方法

無效

• 申請號: 201110172722.1
• 申請日: 2011-06-24
• 公開（公告）號: CN102230018A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 沈萬寬;劉睿;楊湛端;鄧海華;陳健文;陳仲華
• 申請（專利權）人: 廣州甘蔗糖業研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

1.一種甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速檢測方法，包括如下步驟：

1)??提取待檢樣品的全DNA；

2)??以得到的全DNA為模板，以ITS1：5’–?AGTCGTAACAAGGTAGCCGT?-3’?（SEQ?ID?NO.1）和ITS2：5’–?GTGCCAAGGCATCCACC?-3’?（SEQ?ID?NO.2）為引物，進行首輪PCR，得到首輪PCR產物；

3)??以上述PCR產物為模板，以RL2：5’?–GAGACAGTACTTATCACTTCGG-3’?（SEQ?ID?NO.3）和RR2：5’–?CGACGCAGATTGACCAATGATC?-3’?（SEQ?ID?NO.4）為引物，進行二輪PCR；

4)??對二輪PCR產物進行電泳，根據371?bp目的片斷的有無，判斷樣品為陽性或者陰性。

2.根據權利要求1所述的一種甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速檢測方法，其特征在于：首輪PCR的反應體系為：全DNA?1μl（含DNA?10-100?ng），5U/μL的?Taq酶0.2μl，10×含Mg²⁺?PCR反應緩沖液2.5μl，各dNTPs均為2.5?mmol/L的混合液2μl，5μmol/L的ITS1/ITS2引物各1μl，滅菌超純水補足至25μl。

3.根據權利要求1所述的一種甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速檢測方法，其特征在于：首輪PCR的反應程序為：94℃?5min；94℃?30s，56℃?40s，72℃?1min；循環30次；72℃?10min,4℃?保存。

4.根據權利要求1所述的一種甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速檢測方法，其特征在于：二輪PCR的反應體系為：1μl首輪PCR擴增產物或其10倍稀釋液，5μmol/L的引物RL2/RR2各1μl，10×含Mg²⁺?PCR反應緩沖液2.0?μl，各dNTPs均為2.5?mmol/L的混合液1.6μl，5U/μl的?Taq酶0.2μl，滅菌超純水補足至20μl。

5.根據權利要求1所述的一種甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速檢測方法，其特征在于：二輪PCR的反應程序為：94℃預變性2min，1個循環；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35-40個循環；72℃擴增5min，4℃?保存。