[發明專利]紅球菌及用于腈水解合成苯乙酮酸的方法

有效

• 申請號: 201110171332.2
• 申請日: 2011-06-23
• 公開（公告）號: CN102250802A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 何玉財;周瓊;張躍;馬翠鸞;趙希岳;王利群;蔡志強;高大舟;鄭明;李亮;朱孝霖
• 申請（專利權）人: 常州大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/40;C12R1/01
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

本發明公開了土壤中分離的腈水解酶產生菌Rhodococcus?sp.?CCZU10-1及其用于催化甲酰甲腈水解制備苯乙酮酸的方法，屬于微生物技術領域。

背景技術

苯乙酮酸是一種重要的有機合成中間體，廣泛地用于農藥和醫藥等合成。隨著其市場的不斷擴展，對苯乙酮酸的需求不斷增加，應用范圍也逐漸拓寬。目前，國內外已報道了很多苯乙酮酸的生產方法，其中化學合成法主要是：(1)苯甲酰腈水解法，(2)扁桃酸氧化法，(3)傅克酰化法和(4)苯乙烯氧化法。上述各種化學方法已取得了較好的效果，但同時也有一些不足之處，例如，產物中都含有雜質，并且化學合成法通常存在產品收率低、成本高和環境污染嚴重等缺點，與之相比，由于利用生物法實現苯乙酮酸的合成具有反應條件溫和，產品收率高等優點，符合綠色化學的發展要求，而越來越受到國內外學者的青睞。生物法中涉及腈水解的酶系主要有腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶；腈水解酶能將腈水解生成相應的羧酸和氨，具有選擇性好、反應條件溫和及產品純度高等優點，明顯優于化學法水解。然而，少有報道利用苯甲酰甲腈水解酶催化合成苯乙酮酸，篩選新的苯甲酰甲腈水解酶菌株成為當務之急。

發明內容

本發明需要解決的技術問題是公開一種紅球菌的培養及用于腈水解制備苯乙酮酸的方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。

本發明所述的紅球菌Rhodococcus?sp.?CCZU10-1，該菌株已于2011年5月25日保藏在位于中國北京的北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC?No.?4911。

上述紅球菌Rhodococcus?sp.?CCZU10-1，CGMCC?No.?4911，用于催化苯甲酰甲腈生產苯乙酮酸的方法，按照下述步驟進行：

一、菌株的培養：

（1）種子液的搖瓶培養：將所說的紅球菌Rhodococcus?sp.?CCZU10-1，CGMCC?No.?4911，采用本領域常規的方法，在種子液培養基中進行擴增培養在20~40?℃下100~160?rpm的搖床上培養12~36?h，離心、洗滌得到靜息細胞；

（2）發酵罐擴大培養：在5?L發酵罐中加入適量占發酵罐體積50-70%的發酵培養基，接種量占發酵培養基體積的1~10%,?接種至5?L發酵罐中，通氣量1:0.1~1:1?(v/v/m)，攪拌轉速200~450?rpm，溫度20~40?°C，時間15~72?h，離心、洗滌得到靜息細胞；

二、靜息細胞催化苯甲酰甲腈水解生產苯乙酮酸：

將收獲的靜息細胞，以1~100?g濕重/L懸浮于pH為6.0~8.0的體積比為98%:2%-90%:10%的磷酸鉀緩沖溶液-有機溶劑兩相體系中，加入苯甲酰甲腈，使其濃度為10~1000?mM，在20~40?°C和100~160?rpm的恒溫搖床上振蕩反應2~120?h后，離心除去細胞，利用2?M?NaOH溶液調pH至8.5，利用等體積的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6?M?HCl的溶液調pH至1.0，利用等體積的乙醚萃取3次，收集有機相，經無水Na₂SO₄干燥過夜后減壓蒸去溶劑，即得粗產品，然后過硅膠柱純化，洗脫液為體積比為25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通過旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到黃色苯乙酮酸粉末。

其中所述的步驟二也可以采用下述技術方案：海藻酸鈣固定化細胞催化苯甲酰甲腈水解生產苯乙酮酸：

將收獲的靜息細胞采用海藻酸鈣進行固定化，將海藻酸鈣固定化細胞，以1~200?g濕重/L懸浮于pH為7.0~9.0的體積比為98%:2%-90%:10%Tris-HCl緩沖溶液-有機溶劑兩相體系中，加入苯甲酰甲腈，使其濃度為10~1000?mM，在20~40?°C和100~160?rpm的恒溫搖床上振蕩反應2~24?h后，離心除去細胞，利用2?M?NaOH溶液調pH至8.5，利用等體積的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6?M?HCl的溶液調pH至1.0，利用等體積的乙醚萃取3次，收集有機相，經無水Na₂SO₄干燥過夜后減壓蒸去溶劑，即得粗產品，然后過硅膠柱純化，洗脫液為體積比為25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通過旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到黃色苯乙酮酸粉末。