[發(fā)明專利]紅球菌及用于腈水解合成苯乙酮酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110171332.2
• 申請日: 2011-06-23
• 公開（公告）號: CN102250802A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何玉財;周瓊;張躍;馬翠鸞;趙希岳;王利群;蔡志強;高大舟;鄭明;李亮;朱孝霖
• 申請（專利權(quán)）人: 常州大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/40;C12R1/01
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了土壤中分離的腈水解酶產(chǎn)生菌Rhodococcus?sp.?CCZU10-1及其用于催化甲酰甲腈水解制備苯乙酮酸的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

苯乙酮酸是一種重要的有機合成中間體，廣泛地用于農(nóng)藥和醫(yī)藥等合成。隨著其市場的不斷擴展，對苯乙酮酸的需求不斷增加，應(yīng)用范圍也逐漸拓寬。目前，國內(nèi)外已報道了很多苯乙酮酸的生產(chǎn)方法，其中化學(xué)合成法主要是：(1)苯甲酰腈水解法，(2)扁桃酸氧化法，(3)傅克酰化法和(4)苯乙烯氧化法。上述各種化學(xué)方法已取得了較好的效果，但同時也有一些不足之處，例如，產(chǎn)物中都含有雜質(zhì)，并且化學(xué)合成法通常存在產(chǎn)品收率低、成本高和環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點，與之相比，由于利用生物法實現(xiàn)苯乙酮酸的合成具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品收率高等優(yōu)點，符合綠色化學(xué)的發(fā)展要求，而越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的青睞。生物法中涉及腈水解的酶系主要有腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶；腈水解酶能將腈水解生成相應(yīng)的羧酸和氨，具有選擇性好、反應(yīng)條件溫和及產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，明顯優(yōu)于化學(xué)法水解。然而，少有報道利用苯甲酰甲腈水解酶催化合成苯乙酮酸，篩選新的苯甲酰甲腈水解酶菌株成為當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種紅球菌的培養(yǎng)及用于腈水解制備苯乙酮酸的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。

本發(fā)明所述的紅球菌Rhodococcus?sp.?CCZU10-1，該菌株已于2011年5月25日保藏在位于中國北京的北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC?No.?4911。

上述紅球菌Rhodococcus?sp.?CCZU10-1，CGMCC?No.?4911，用于催化苯甲酰甲腈生產(chǎn)苯乙酮酸的方法，按照下述步驟進行：

一、菌株的培養(yǎng)：

（1）種子液的搖瓶培養(yǎng)：將所說的紅球菌Rhodococcus?sp.?CCZU10-1，CGMCC?No.?4911，采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法，在種子液培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)在20~40?℃下100~160?rpm的搖床上培養(yǎng)12~36?h，離心、洗滌得到靜息細(xì)胞；

（2）發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)：在5?L發(fā)酵罐中加入適量占發(fā)酵罐體積50-70%的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1~10%,?接種至5?L發(fā)酵罐中，通氣量1:0.1~1:1?(v/v/m)，攪拌轉(zhuǎn)速200~450?rpm，溫度20~40?°C，時間15~72?h，離心、洗滌得到靜息細(xì)胞；

二、靜息細(xì)胞催化苯甲酰甲腈水解生產(chǎn)苯乙酮酸：

將收獲的靜息細(xì)胞，以1~100?g濕重/L懸浮于pH為6.0~8.0的體積比為98%:2%-90%:10%的磷酸鉀緩沖溶液-有機溶劑兩相體系中，加入苯甲酰甲腈，使其濃度為10~1000?mM，在20~40?°C和100~160?rpm的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)2~120?h后，離心除去細(xì)胞，利用2?M?NaOH溶液調(diào)pH至8.5，利用等體積的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6?M?HCl的溶液調(diào)pH至1.0，利用等體積的乙醚萃取3次，收集有機相，經(jīng)無水Na₂SO₄干燥過夜后減壓蒸去溶劑，即得粗產(chǎn)品，然后過硅膠柱純化，洗脫液為體積比為25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機溶劑，得到黃色苯乙酮酸粉末。

其中所述的步驟二也可以采用下述技術(shù)方案：海藻酸鈣固定化細(xì)胞催化苯甲酰甲腈水解生產(chǎn)苯乙酮酸：

將收獲的靜息細(xì)胞采用海藻酸鈣進行固定化，將海藻酸鈣固定化細(xì)胞，以1~200?g濕重/L懸浮于pH為7.0~9.0的體積比為98%:2%-90%:10%Tris-HCl緩沖溶液-有機溶劑兩相體系中，加入苯甲酰甲腈，使其濃度為10~1000?mM，在20~40?°C和100~160?rpm的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)2~24?h后，離心除去細(xì)胞，利用2?M?NaOH溶液調(diào)pH至8.5，利用等體積的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6?M?HCl的溶液調(diào)pH至1.0，利用等體積的乙醚萃取3次，收集有機相，經(jīng)無水Na₂SO₄干燥過夜后減壓蒸去溶劑，即得粗產(chǎn)品，然后過硅膠柱純化，洗脫液為體積比為25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機溶劑，得到黃色苯乙酮酸粉末。