[發明專利]TL固定化酶及其應用

有效

• 申請號: 201110170701.6
• 申請日: 2011-06-23
• 公開（公告）號: CN102839166A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 鄭妍;辛本榮;楊天奎;徐學兵
• 申請（專利權）人: 豐益(上海)生物技術研發中心有限公司
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;C12P7/64
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 楊昀

技術領域

本發明屬于食品和化工領域。更具體而言，本發明涉及針對TL脂肪酶的固定化酶方法及其應用。

背景技術

酶作為一種生物催化劑，具有底物選擇性，反應條件溫和，污染小等優勢，克服了傳統工業催化劑帶來的反應條件苛刻，反應副產物污染環境等缺點，具有很好的應用潛力。尋找催化活力高，反應條件溫和的酶，或是對現有酶進行改造使其更適應生產應用，是未來酶工程在工業中應用的主要發展方向。

固定化酶技術是將游離的酶通過物理或者化學手段將其束縛或限制于一定區域內，使其仍然能進行特有的催化反應并能回收重復使用的一種技術。由于上述優點，使得很多科研工作者展開了對固定化酶的細致研究。在1967年，固定化酶首次被應用在拆分氨基酸工業中。近年來隨著有機化學、蛋白質化學、材料科學等的發展，固定化酶技術取得了長足的進步。

脂肪酶是催化油脂發生水解、酯交換、酯化反應的一類酶，它能夠特異性地在油水界面上發揮催化活性，在食品、造紙、皮革、洗滌劑、制藥等工業上有著巨大的應用。然而，天然酶穩定性差，反應后難以純化，不能重復利用，不僅降低了酶的使用效率，提高了生產成本，而且難以實現連續化操作，限制了其在工業上的應用。在此背景下，固定化酶技術成為解決上述生產瓶頸的一種有效途徑。

TL脂肪酶是在嗜熱絲孢菌(Thermomyces?Lanuginosus)中發現的一類脂肪酶，其主要用于油脂的水解、三甘油酯的改性及單甘脂和甘二酯的生產。液體的TL脂肪酶主要用于水解反應。固定化的TL酶用來催化酯交換反應，其優點是可以重復利用，降低生產成本。

WO8906278A1描述了一種固定化TL酶的方法，通過培養腐殖霉屬的真菌或經過基因改造的腐殖霉屬真菌獲得含有脂肪酶的發酵液，以酚醛型或者丙烯酸型樹脂為固定化載體，固定化過程為將一定量的一定pH值酶液加入處理好的弱堿性大孔型離子交換樹脂中，在室溫下震蕩8h，然后水洗，室溫真空干燥，得產品。

EP1239045A1描述了一種固定化TL酶的方法，具體為將脂肪酶粉末溶解在磷酸緩沖液中，加入乙醇和聚丙烯型樹脂ACCUREL?MP1001，室溫下震蕩過夜。通過過濾收集固定化酶，用緩沖液清洗，室溫下進行干燥。

然而，到目前為止，市場上現有的TL固定化酶并不能滿足生產要求。其催化的酯交換反應中發現產物中存在大量的皂，大量浪費原料，增加成本，分析其原因可能是不同類型的載體與酶結合的過程中存在一些無法克服的技術問題造成或者載體與酶固定過程中與反應介質的沖突。因此目前固定化的TL需要大量的油脂洗脫，造成大量的原料浪費。同時為下游的分離提純帶來了巨大的困難，限制了其在油脂工業上的應用。

因此，本領域中迫切需要開發出新的固定化TL酶方法，使得TL酶保持較高活力且在反應中不產生皂，從而擴大TL脂肪酶在食品工業的應用范圍，并克服了現有固定化TL酶在生產中產生皂的問題。

發明內容

本發明的目的之一正是提供一種新的TL酶固定化方法。本發明的另一主要目的是提供一種固定化的TL酶。本發明的目的還在于提供本發明的固定化TL酶在工業中的應用。

在本發明的第一方面中，提供了一種制備固定化脂肪酶的方法，所述方法包括步驟：

a)對載體進行前處理，所述載體選自：離子交換樹脂或骨架為聚苯乙烯的大孔吸附樹脂；

b)提供脂肪酶，并任選在其中加入酶蛋白交聯劑；

c)將步驟a)中所得的經前處理的載體與步驟b)中所提供的脂肪酶接觸，使所述脂肪酶固定于所述經前處理的載體；

d)干燥步驟c)中所得的固定有脂肪酶的載體，以獲得所述固定化脂肪酶。

在一個優選例中，所述聚苯乙烯的大孔吸附樹脂可為聚苯乙烯-二乙烯苯骨架的大孔吸附樹脂。

在本發明的一個實施方式中，所述載體選自：極性大孔吸附樹脂、非極性大孔吸附樹脂、陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂。

在本發明的另一個實施方式中，所述非極性大孔吸附樹脂選自：D101、HPD100A、AmberliteXAD-4、HPD100、HPD300、HPD700、X-5、XAD-4或HP20；

所述極性大孔吸附樹脂選自：D201、LSA-10或Amberlite?XAD7HP；

所述陽離子交換樹脂選自：D113、D001或Ambetlite?IRC50；

所述陰離子交換樹脂選自：D301或Styrene-DVB?201×2。