[發(fā)明專利]比伐盧定的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110170669.1
• 申請日: 2011-06-23
• 公開（公告）號: CN102286076A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 文永均;謝期林;王曉莉;郭德文;曾德志
• 申請（專利權(quán)）人: 成都圣諾科技發(fā)展有限公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 成都虹橋?qū)＠聞?wù)所 51124
• 代理人: 羅麗;武森濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于多肽藥物制備方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及比伐盧定的制備方法。

背景技術(shù)

比伐盧定(Bivalirudin)屬于直接凝血酶抑制劑(direct?thrombin?inhibitor，DTI)，由20個氨基酸殘基組成。直接凝血酶抑制劑(DTI)是一組不需要輔助因子參與而直接抑制凝血酶活性的多肽，它不僅有抗凝血功能，還能抑制血小板的聚集。與其他抗凝藥相比，其藥理作用及藥動學(xué)特點(diǎn)更優(yōu)越，尤其在心血管疾病中有良好的用途。

比伐盧定為水蛭素衍生物(片段)，人工合成的包含20個氨基酸殘基的多肽。它主要由兩部分構(gòu)成，一部分是氨基末端(N端)的短肽鏈，含有苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸序列，能與凝血酶的活性部位發(fā)生特異性結(jié)合，另一部分是含羧基末端(C端)的12肽鏈，兩部分靠四甘氨酸連接，它們與凝血酶的兩個結(jié)合部位都有很高的親和力。比伐盧定與凝血酶的結(jié)合是可逆的，結(jié)合后很容易在凝血酶的活性部位斷開成兩部分并分解出多肽鏈中的脯氨酸-精氨酸序列，使凝血酶的催化活性很快恢復(fù)，所以它的半衰期只有20～25min。半衰期短使它比水蛭素更安全。比伐盧定主要經(jīng)肽酶降解后清除，少部分以原型經(jīng)腎排泄，所以在腎功能不全時使用安全。

比伐盧定具有以下的結(jié)構(gòu)：

D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-

Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH

有關(guān)比伐盧定的制備方法，國內(nèi)外有大量的報道，世界專利WO98/50563，報道了一系列多肽的基因工程制備方法，其中包括比伐盧定。

中國專利200910028793報道了液相合成方法，首先逐步合成三個全保護(hù)的片段：N-端全保護(hù)的6肽、中段全保護(hù)的6肽、C-端全保護(hù)的8肽，然后將這三個片段依次縮合得到全保護(hù)的比伐盧定，最后脫除所有保護(hù)基團(tuán)得到比伐盧定粗品，再經(jīng)過高效液相色譜純化，得到比伐盧定純品。

Okayama?et?al.(1996，Chem.Pharm.Bull.44：1344-1350)和Steinmetzer?et?al.(1999，Eur.J.Biochem.265：598-605)報道了比伐盧定的Fmoc固相合成法，采用王樹脂為開始的載體樹脂，依次接入保護(hù)氨基酸，所得肽樹脂采用三氟醋酸(TFA)酸解。

世界專利WO91/02750報道了比伐盧定的Boc固相合成法，采用Boc-Leu-Mrrifiled樹脂為開始的載體樹脂，依次接入保護(hù)氨基酸，所得肽樹脂采用氟化氫(TFA)酸解。

US20070093423、US20100029916、US20100273982報道了一種高純度比伐盧定制備方法，采用的方法為固相片段縮合，所得比伐盧定的純度大于98.5％，總雜質(zhì)小于1.5％，每個雜質(zhì)小于1.0％，[Asp9-比伐盧定]小于0.5％。

US20100056755報道了一種商業(yè)化比伐盧定制備方法，采用的方法為固相片段縮合；US2008005155報道了一種制備比伐盧定的方法，采用的開始樹脂為Trityl-Cl樹脂，4-Methyltrityl-Cl樹脂，4-Methoxytrityl-Cl樹脂，或2-Cl?Trity-Cl樹脂，F(xiàn)moc-Leu-Wang樹脂，用TFA酸解，C18液相色譜純化；US?20090062511、US20100292436報道了一種改進(jìn)的比伐盧定制備方法，與上述專利類似，為制備方法優(yōu)化專利。

比伐盧定結(jié)構(gòu)中含有一個Gly-Gly-Gly-Gly片段，在固相法依次接入Fmoc-Gly過程中，由于Gly自身的特性，使產(chǎn)品中產(chǎn)生以下雜質(zhì)：[+1Gly]-比伐盧定，[+2Gly]-比伐盧定，[-1Gly]-比伐盧定，[-2Gly]-比伐盧定，而這些雜質(zhì)與比伐盧定自身的極性相近，所以在純化的時候很難完全純化掉，產(chǎn)品總收率無法得到有效提高，產(chǎn)品純度降低，影響用藥的安全性。

以上專利均無法解決比伐盧定結(jié)構(gòu)Gly增加和減少問題，為了解決上述問題，以色利NOVETIDE公司W(wǎng)O2010117725專利，在接肽過程中使用Fmoc-Gly-Gly-OH為原料接入Gly-Gly-Gly-Gly片段，但僅僅解決了[+1Gly]-比伐盧定和[-1Gly]-比伐盧定雜質(zhì)的產(chǎn)生，而無法解決[+2Gly]-比伐盧定和[-2Gly]-比伐盧定的產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容