[發(fā)明專利]頂頭孢霉菌發(fā)酵過程中代謝物變化規(guī)律的分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110170538.3
• 申請(qǐng)日: 2011-06-23
• 公開（公告）號(hào): CN102262136A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 元英進(jìn);楊揚(yáng);盧華;陳堯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種頂頭孢霉菌發(fā)酵過程中代謝物變化規(guī)律的分析方法。

背景技術(shù)

頭孢類抗生素是β-內(nèi)酰胺類抗生素的一種，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的生成而達(dá)到殺菌的目的。由于其高抗細(xì)菌感染活性和低副作用發(fā)生率，在臨床上廣泛應(yīng)用。作為頭孢菌素類藥物合成的原料，對(duì)頭孢菌素C的發(fā)酵研究所取得的成就遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及新一代的頭孢藥物的開發(fā)。因此需要更多的關(guān)于頭孢菌素的生產(chǎn)過程的研究，以獲得更大的頭孢菌素發(fā)酵效價(jià)。

代謝組學(xué)可通過考察生物體系受刺激或擾動(dòng)后其代謝產(chǎn)物的變化，來研究生物體系。代謝組學(xué)的關(guān)鍵在于實(shí)驗(yàn)得到的大量數(shù)據(jù)背后的信息挖掘過程。傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)處理方法得到的信息相對(duì)單一，并且仍需大量的人工操作，這樣往往使大量有價(jià)值的信息流失。尋找一種較為系統(tǒng)的代謝組數(shù)據(jù)分析方法就顯的尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種頂頭孢霉菌發(fā)酵過程中代謝物變化規(guī)律的分析方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

頂頭孢霉菌發(fā)酵過程中代謝物變化規(guī)律的分析方法，包括下述步驟：

(1)在頭孢菌素C生產(chǎn)菌株頂頭孢霉菌的發(fā)酵前期、中期和后期，各取2-3個(gè)取樣點(diǎn)取100-300ml發(fā)酵液離心，棄上清；

(2)沉淀部分加入100-300ml?pH值為7.2的磷酸緩沖液，混勻后離心；沉淀細(xì)胞于液氮中淬滅以終止細(xì)胞的代謝反應(yīng)，用液氮研磨至細(xì)粉狀；

(3)取步驟(2)獲得的細(xì)粉狀細(xì)胞20-80mg置于離心管中，加入0.5-1.5ml-40℃～-50℃的體積濃度為50％的甲醇水溶液為提取液，并加入10μl～20μl的0.14mg/ml氘標(biāo)記的丁二酸水溶液為內(nèi)標(biāo)物，混勻；置于液氮中反復(fù)凍融2-4次，每次凍0.5-2.5min；離心收集上清并冷凍干燥；

(4)向步驟(3)獲得的凍干樣品中加入40-60μl的20mg/ml甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液，30-40℃水浴，進(jìn)行肟化反應(yīng)60-100min；再加入50-100μl的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，30-40℃水浴，進(jìn)行硅烷化反應(yīng)50-70min；

(5)用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀測定樣品成分及相對(duì)含量：

將1μl硅烷化的樣品進(jìn)到氣相色譜中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規(guī)格為30m×0.25mm?i.d.，運(yùn)用Masslynx軟件對(duì)樣品中的代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，對(duì)一種代謝物的多種預(yù)測結(jié)果的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析以最終確定代謝物結(jié)構(gòu)，根據(jù)定性結(jié)果及保留時(shí)間對(duì)各樣品中的各種代謝物面積進(jìn)行獲取，將每個(gè)樣品中的各個(gè)代謝物峰面積與同個(gè)樣品中的內(nèi)標(biāo)物峰面積相比，得到各個(gè)代謝物的相對(duì)峰面積，可表示樣品中代謝物的相對(duì)含量；

(6)利用Matlab軟件對(duì)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，整體分析各個(gè)樣品間的代謝差異；利用Expander軟件對(duì)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，以分析各個(gè)代謝物在樣品間的代謝差異；通過代謝物定性，進(jìn)而對(duì)代謝物進(jìn)行分類，對(duì)各類代謝物在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律進(jìn)行分析。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)能夠準(zhǔn)確的對(duì)頂頭孢霉菌的發(fā)酵代謝物進(jìn)行定性；

(2)利用內(nèi)標(biāo)物對(duì)發(fā)酵過程各樣品的代謝物進(jìn)行相對(duì)含量分析，能夠達(dá)到絕對(duì)定量相同的效果，并且更加方便快捷；

(3)利用多種軟件進(jìn)行分析，可從多個(gè)角度對(duì)頂頭孢霉菌在發(fā)酵中的代謝特點(diǎn)進(jìn)行研究，使代謝規(guī)律的分析更加完整。

附圖說明

圖1為頂頭孢霉菌發(fā)酵過程代謝物的總離子流圖。

圖2為保留時(shí)間為15.92分鐘的代謝物的質(zhì)譜圖。

圖3為包含特定特征片段的特征峰色譜圖。

圖4為對(duì)特征峰進(jìn)行定性得到的不同定性結(jié)果。

圖5為頂頭孢霉菌不同發(fā)酵時(shí)期代謝特征的主成分分析結(jié)果。

圖6為頂頭孢霉菌不同代謝物在不同發(fā)酵時(shí)期的變化趨勢分析結(jié)果。

圖7為頭孢菌素C中試和生產(chǎn)過程中胞內(nèi)與頭孢菌素C合成密切相關(guān)的前體氨基酸及相關(guān)氨基酸的變化圖。a為α-氨基己二酸，b為半胱氨酸，c為纈氨酸，d為賴氨酸，e為蛋氨酸。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明但并不用于限制本發(fā)明，例如：頂頭孢霉菌，除本發(fā)明公開的幾種外，其它的用于發(fā)酵生產(chǎn)頭孢菌素C的頂頭孢霉菌也可以用于本發(fā)明。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1

頂頭孢霉菌發(fā)酵過程中代謝物變化規(guī)律的分析方法，包括如下步驟：