[發明專利]頂頭孢霉菌發酵過程中代謝物變化規律的分析方法

有效

• 申請號: 201110170538.3
• 申請日: 2011-06-23
• 公開（公告）號: CN102262136A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 元英進;楊揚;盧華;陳堯
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.頂頭孢霉菌發酵過程中代謝物變化規律的分析方法，其特征包括下述步驟：

(1)在頭孢菌素C生產菌株頂頭孢霉菌的發酵前期、中期和后期，各取2-3個取樣點取100-300ml發酵液離心，棄上清；

(2)沉淀部分加入100-300ml?pH值為7.2的磷酸緩沖液，混勻后離心；沉淀細胞于液氮中淬滅以終止細胞的代謝反應，用液氮研磨至細粉狀；

(3)取步驟(2)獲得的細粉狀細胞20-80mg置于離心管中，加入0.5-1.5ml-40℃～-50℃的體積濃度為50％的甲醇水溶液為提取液，并加入10μl～20μl的0.14mg/ml氘標記的丁二酸水溶液為內標物，混勻；置于液氮中反復凍融2-4次，每次凍0.5-2.5min；離心收集上清并冷凍干燥；

(4)向步驟(3)獲得的凍干樣品中加入40-60μl的20mg/ml甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液，30-40℃水浴，進行肟化反應60-100min；再加入50-100μl的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，30-40℃水浴，進行硅烷化反應50-70min；

(5)用氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀測定樣品成分及相對含量：

將1μl硅烷化的樣品進到氣相色譜中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規格為30m×0.25mm?i.d.，運用Masslynx軟件對樣品中的代謝物進行結構預測，對一種代謝物的多種預測結果的質譜圖進行分析以最終確定代謝物結構，根據定性結果及保留時間對各樣品中的各種代謝物面積進行獲取，將每個樣品中的各個代謝物峰面積與同個樣品中的內標物峰面積相比，得到各個代謝物的相對峰面積，可表示樣品中代謝物的相對含量；

(6)利用Matlab軟件對預處理后的數據進行主成分分析，整體分析各個樣品間的代謝差異；利用Expander軟件對預處理后的數據進行聚類分析，以分析各個代謝物在樣品間的代謝差異；通過代謝物定性，進而對代謝物進行分類，對各類代謝物在發酵過程中的變化規律進行分析。