[發明專利]表達NY-ESO-1重組恥垢分枝桿菌的制備及應用

無效

• 申請號: 201110168492.1
• 申請日: 2011-06-21
• 公開（公告）號: CN102839186A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 陳丹丹;徐帆洪;高丹
• 申請（專利權）人: 上海生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/11;C12N15/56;C12N15/12;C12N15/74;C12N1/21;A61K48/00;A61K38/17;A61P35/00;C12R1/34
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 楊昀

技術領域

本發明屬于生物學和基因工程學領域，具體而言涉及一種表達腫瘤/睪丸抗原NY-ESO-1的恥垢分枝桿菌、其制備及該重組恥垢分枝桿菌在免疫治療腫瘤中的應用。

背景技術

恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)是一種非典型的分枝桿菌，與典型的分枝桿菌BCG相比，恥垢分枝桿菌生長快速，對人、小鼠、豚鼠等動物均無致病性，作為一種細菌疫苗載體有著廣闊的應用前景。

BCG作為淺表性膀胱癌的免疫輔助治療已有很長的歷史，但活的BCG仍存在毒性，有可能引起結核桿菌的感染，尤其對免疫缺陷型的病人存在很大的危害。初步研究表明無細胞恥垢分枝桿菌疫苗具有良好的免疫調節作用，對結核分枝桿菌(MTB)感染的豚鼠具有明顯保護效果，并具有較高安全性，目前已進入II期臨床研究[1]。此外，恥垢分枝桿菌單位時間內的分泌型蛋白產量是BCG的50-100倍。因此，以恥垢分枝桿菌作為一種低成本且有效的疫苗載體表達外源抗原已成為目前疫苗研究中的熱點。

Jae-Sung?Yu等[2]研究了表達HIV-1蛋白的重組恥垢分枝桿菌對小鼠的免疫作用，結果表明經重組恥垢分枝桿菌免疫的小鼠成功產生了HIV抗體及特異的T淋巴細胞反應及IFN-γ。Lin?Lu等[3]構建了表達人幽門螺桿菌26K外膜蛋白(OMP6)的重組恥垢分枝桿菌，經該重組恥垢分枝桿菌免疫后的小鼠對幽門螺桿菌的感染產生了明顯的免疫保護作用，其腸道中幽門螺桿菌菌落急劇減少，由此該作者認為該重組恥垢分枝桿菌可作為一種低成本的、有效的針對幽門螺桿菌的聯合疫苗。

NY-ESO-1抗原是腫瘤-睪丸抗原家族中的重要成員，在多種腫瘤細胞上表達，包括黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌和膀胱癌，并且是迄今發現的最具免疫原性的腫瘤抗原之一。

NY-ESO-1抗原可在NY-ESO-1表達陽性的腫瘤患者體內引起自發性體液免疫反應和特異性T細胞免疫反應[4]，因此該抗原被認為是目前最好的腫瘤候選疫苗之一，在腫瘤免疫治療中頗具發展潛力。

目前，針對NY-ESO-1的多肽疫苗大多是基于它的不同表位(如p156-167、p157-160、p157-170)，人工合成這些抗原肽或者將這些抗原肽與伴侶蛋白(如HSP)融合作為疫苗進行研究。

然而，本領域中仍然迫切需要開發出更有效的NY-ESO-1的多肽疫苗，以獲得更為顯著的免疫效果。

發明內容

本發明的目的之一是提供帶有NY-ESO-1基因的分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達質粒，其可將NY-ESO-1分別與β-半乳糖苷酶信號肽及全序列融合表達。

本發明的另一個目的是提供一種能將腫瘤/睪丸抗原NY-ESO-1錨定表達在細胞壁或細胞膜上的恥垢分枝桿菌工程菌株。

本發明的再一個目的是提供了該工程菌株在腫瘤免疫治療中的應用。采用本發明重組恥垢分枝桿菌免疫對象，可在對象體內提高抗原NY-ESO-1的提呈及誘發機體產生細胞、體液免疫反應，進而殺傷表達NY-ESO-1的腫瘤細胞，起到預防和/或治療腫瘤的效果。

在本發明的第一方面中，提供了一種用于重組腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-1蛋白表達的質粒，所述質粒包含：

(a)β-半乳糖苷酶信號肽編碼序列或β-半乳糖苷酶編碼序列；和

(b)NY-ESO-1編碼序列。

在本發明的一個實施方式中，所述重組NY-ESO-1蛋白是β-半乳糖苷酶信號肽序列與NY-ESO-1的融合蛋白、或β-半乳糖苷酶全長序列與NY-ESO-1的融合蛋白。

在一個優選例中，所述融合蛋白定位于重組恥垢分枝桿菌的細胞壁或細胞膜上，優選細胞壁上。

在另一個優選例中，所述融合蛋白中的β-半乳糖苷酶信號肽序列或全長序列與NY-ESO-1直接相連或通過連接肽序列相連，優選所述連接肽的長度為1～30個氨基酸殘基，優選5～25個氨基酸殘基，更優選10～23個氨基酸殘基。

在另一個優選例中，所述融合蛋白包含SEQ?ID?NO：6或SEQ?ID?NO：8所示的序列，優選為SEQ?ID?NO：6或SEQ?ID?NO：8所示的序列。