[發明專利]一種生產高活性和高純度利福霉素SV的方法

有效

• 申請號: 201110168410.3
• 申請日: 2011-06-21
• 公開（公告）號: CN102286398A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 趙國屏;趙維;袁華;鐘怡;覃重軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/09;C12N15/53;C12N15/54;C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 楊昀

技術領域

本發明涉及生物工程和制藥領域。更具體而言，本發明涉及細胞色素P450基因或轉酮酶基因或它們所編碼的蛋白在調控利福霉素SV轉化為利福霉素B中的用途，通過生物工程方法獲得的生產高活性、高純度利福霉素SV的菌株及制備該菌株的方法，以及利用該菌株生產高活性、高純度利福霉素SV的方法。?

背景技術

地中海擬無枝菌酸菌(Amycolatopsis?mediterranei)是1957年從法國圣拉斐爾(St.Raphael)附近的土樣中分離出來的一種菌種，它是一種可以生成重要抗生素利福霉素的放線菌。?

利福霉素屬于安莎類抗生素(ansamycins)，主要用于治療由結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis)和麻風分枝桿菌(Mycobacterium?leprae)引起的結核病和麻風，對肺炎球菌(Pneumococcus)及其它革蘭氏陽性菌引起的各種感染也十分有效(Lal，Khanna等，1995)。利福霉素可以結合到原核生物中依賴于DNA的RNA聚合酶上，從而特異性地抑制依賴于DNA的RNA的合成而起到抑菌的作用(Floss和Yu?2005)。?

最初分離的地中海擬無枝菌酸菌能夠合成一組結構相關的利福霉素混合物。后來，經過一系列物理、化學方法誘變，使得地中海擬無枝菌酸菌在工業上所合成的主要組分為利福霉素B(Floss和Yu?2005)。利福霉素B的產量比較高，但其抑菌活性比較低。在發酵得到Rf_B后，再經過化學或酶學方法轉化得到高活性的利福霉素SV，最后進一步得到臨床用的利福平(rifampicin)或其它藥用衍生物(Floss和Yu?2005)。?

但是，隨著對利福平有抗性的細菌的快速出現，其它化學半合成衍生物如利福布汀(rifabutin)和利福噴汀(rifapentine)相繼進入臨床(Floss和Yu?2005)。由于這些?化學半合成藥物的直接前體都是利福霉素SV，所以，得到高產量高純度的利福霉素生物合成中間產物Rf_SV，是工業生產的重要步驟。?

很多實驗室和利福霉素生產公司利用物理或化學方法對工業生產菌株進行誘變，得到了一些可以直接生產利福霉素SV的地中海擬無枝菌酸菌菌株。但是，這些菌株往往產量較低，容易發生回復突變，或者還夾雜著許多其它不需要的利福霉素衍生物，給下游的分離純化帶來諸多不便。?

為了篩選得到能夠在遺傳上穩定生產高純度Rf_SV的地中海擬無枝菌酸菌菌株，通過解析利福霉素生物合成途徑，從而利用分子生物學及基因工程方法改造獲得目的生產菌株，一直是科學家們努力的目標。1998年，Floss等人以3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)合酶基因rifK為探針克隆了地中海擬無枝菌酸菌染色體上含有利福霉素合成基因簇的一段約100kb?DNA片段。隨后，其中的大部分基因的功能被實驗鑒定(Floss和Yu?2005；Xu，Wan等，2005)。?

利福霉素的合成是以AHBA為起始單元，丙二酰輔酶A(2分子)和甲基丙二酰輔酶A(8分子)為延伸單元合成了第一個中間體前安莎霉素X(proansamycinX)，然后，前安莎霉素X經過氧化還原、乙酰化、甲基化等多種修飾經Rf_SV并最終得到Rf_B。利福霉素合成途徑如下式所示，其中利福霉素S是利福霉素SV的氧化形式，二者之間可以相互轉化。?

但是，對于利福霉素合成途徑中的最后一步(也可能是幾步)反應，即從Rf_SV到Rf_B轉化所利用的基因以及酶催化反應機理，至今不是很明了。?

因此，本領域仍然迫切需要對利福霉素的合成途徑和所涉及的生物過程進行深入的研究，以開發出通過對菌株中特定基因的篩選或改造實現對利福霉素SV到利福霉素B的轉化的控制從而有利于可控的利福霉素生產的方法，尤其需要開發出可高效生產高純度Rf_SV的菌株和利用該菌株生產Rf_SV的方法。?

發明內容

本發明的主要目的之一是提供參與利福霉素SV轉化為利福霉素B的基因及其用途。本發明的另一主要目的正是提供一種可生產高活性、高純度利福霉素SV的菌株，以及制備(尤其是通過基因工程方法)和篩選該菌株的方法。本發明的另一主要目的是提供一種利用該菌株生產高活性、高純度利福霉素SV的方法。?

在本發明的第一方面，提供了細胞色素P450或轉酮酶基因或它們所編碼的蛋白的用途，其用于調控利福霉素SV向利福霉素B的轉化。?