[發明專利]檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列和試劑盒

有效

• 申請號: 201110168198.0
• 申請日: 2011-06-21
• 公開（公告）號: CN102230015A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 高文娜;王中康;周琦;黃魁建;汪萬春;李建光;李子龍;江麗輝;呂玉峰;邊勇;王文靜;鄧叢良;梁新苗
• 申請（專利權）人: 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 李超

1.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物，其特征在于：為序列表SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2的寡核苷酸序列。

2.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針，其特征在于：為序列表SEQ?ID?No.3的寡核苷酸序列。

3.根據權利要求2所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針，其特征在于：所述探針的5’端連接熒光報告基團FAM，3’端連接熒光淬滅基團BHQ1。

4.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：該試劑盒含有檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物和檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針；所述檢測引物為序列表SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2的寡核苷酸序列，所述探針為序列表SEQ?ID?No.3的寡核苷酸序列，探針的5’端連接熒光報告基團FAM，3’端連接熒光淬滅基團BHQ1。

5.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于由以下組分組成：

（1）PCR反應液：由2×反應液Premix?EX?Taq、引物PBAF、引物PBAR和探針組成；其中，引物PBAF為序列表SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR為序列表SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列，探針為序列表SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列，探針5′端標記報告熒光染料FAM，3′端標記淬滅熒光染料BHQ1；

（2）無DNA酶的滅菌純化水；

（3）陰性對照：1mL×1管；研磨無菌健康洋蔥鱗球莖，用0.01mol/L?pH7.2?PBS緩沖鹽溶液制成20%懸液，121℃滅活30min；

（4）陽性對照：1mL×1管；為含有洋蔥腐爛病菌Bga核糖體基因保守區序列SEQ?ID?NO.4的重組質粒，Ct值為22.0～28.0。

6.根據權利要求5所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述反應液Premix?EX?Taq的終濃度為1×，引物PBAF的終濃度為0.3uM、引物PBAR的終濃度為?0.3uM，探針的終濃度為0.1uM。

7.根據權利要求5所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述陽性對照的制備方法為：用SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示的引物序列對洋蔥腐爛病菌進行PCR反應，回收PCR擴增產物，獲得高純度的138?bp?核糖體基因保守區序列SEQ?ID?No.4，與pGEM-T?easy載體進行連接，轉化E.coli?Competent?Cells?DH5α感受態細胞，使用Takara?MiniBEST?Plasmid?Purification?Kit?Ver?2.0質粒提取試劑盒提取DNA，經PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質粒作為陽性對照，命名為pGEM-Bga；10倍連續梯度稀釋裂解液，測定Ct值，Ct值為22.0～28.0者作為陽性對照。

8.根據權利要求5或6或7所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：該試劑盒還含有（5）細菌基因組DNA提取試劑盒。