[發明專利]檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列和試劑盒

有效

• 申請號: 201110168198.0
• 申請日: 2011-06-21
• 公開（公告）號: CN102230015A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 高文娜;王中康;周琦;黃魁建;汪萬春;李建光;李子龍;江麗輝;呂玉峰;邊勇;王文靜;鄧叢良;梁新苗
• 申請（專利權）人: 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 李超

技術領域

本發明涉及檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列和試劑盒，屬于植物檢驗檢疫領域。

背景技術

洋蔥腐爛病菌（Burkholderia?gladioli?pv.?alliicola）隸屬于原核生物界(Procaryoces)、薄壁菌門(Gracilicutes)、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、唐菖蒲伯克霍爾德菌（Burkholderia?gladioli）。唐菖蒲伯克霍爾德菌（Burkholderia?gladioli）是一種引起唐菖蒲球莖腐爛的病原菌，Severini在1913年的文獻中最早描述了這種病原菌，并將其命名為Pseudomonas?gladioli。1992年，Pseudomonas?gladioli與其它六個同屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）?rRNA?Group?Ⅱ的菌種一起被劃分到了一個新屬——伯克霍爾德菌屬（Burkholderia），從而被命名為Burkholderia?gladioli。

洋蔥腐爛病菌最初只是被當成一種植物病原菌。寄主植物主要是蔥屬植物（Allium?cepa）和郁金香屬（Tulipa?spp.）。主要致病癥狀是鱗莖的內部鱗片腐爛，初期外觀看不到癥狀，但后期整個鱗莖變軟，可看到大量細菌分泌物。在葉片上也可產生干燥的壞死斑。洋蔥腐爛病菌侵染洋蔥葉片后，一到兩片葉片會枯萎變白，并且脫落，病原菌由葉片再侵染至球莖。受侵染的洋蔥鱗球莖，先期外部無明顯特征，只在鱗球莖頸部出現腐爛，剖開后，發現內部一到兩個小鱗莖已呈水浸狀。后期肉質鱗狀組織出現水浸狀，由白黃色變為淺褐色，逐漸腐爛變軟，在病害發病后期會有粘性、腐爛難聞液體流出，直至整個球莖變干、枯萎。田間發病率可達到?89.1?%。傳播途徑包括帶菌種子、鱗球莖，土壤等。

1985年，Christenson首次報道了Burkholderia?gladioli?感染囊性纖維化（CF，Cistic?Fibrosis）病人呼吸道的病例。接著，陸續在慢性肉芽腫和免疫功能減弱的病人體內發現了Burkholderia?gladioli。Burkholderia?gladioli感染的病癥還包括敗血病、膿腫、骨髓炎、角膜炎和淋巴腺炎。Burkholderia?gladioli可能主要導致CF病人的急性感染以及肺移植術后的血液感染，目前還沒有Burkholderia?gladioli在病人與病人之間傳播的報道。

洋蔥腐爛病菌是引起洋蔥腐爛的高風險檢疫性病菌，其準確檢測和鑒定在檢驗檢疫工作中具有重要意義。鑒于我國目前沒有洋蔥腐爛病的發生危害報道，為了減少境外洋蔥腐爛病菌傳入的風險、保護公眾健康，本發明研究開發出一種特異的洋蔥腐爛病菌檢測技術。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列。

本發明要解決的另一個技術問題是提供檢測洋蔥腐爛病菌的試劑盒。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物，為序列表SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2的寡核苷酸序列。

檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針，為序列表SEQ?ID?No.3的寡核苷酸序列。

所述探針的5’端連接熒光報告基團FAM，3’端連接熒光淬滅基團BHQ1。

本發明根據?NCBI?數據庫中?Burkholderia?gladioli?pv.?alliicola?ITS?基因序列保守區，設計并經大量篩選得到最佳引物和探針。探針5′端標記報告熒光染料6-Carboxy?fluorescein?(FAM)，3′端標記淬滅熒光染料BHQ1。引物和探針由寶生物工程有限公司合成。上游引物PBAF：5′-?GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC?-3′（SEQ?ID?No.1）；下游引物PBAR：5′-?ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC?-3′（SEQ?ID?No.2）；探針為：FAM-ATTGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1?（SEQ?ID?No.3）。