[發(fā)明專利]一種抗結(jié)核病藥物高通量篩選模型的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110166552.6
• 申請(qǐng)日: 2011-06-20
• 公開（公告）號(hào): CN102839144A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 岑山;賈平平;張義;李曉宇;周金明;殷霄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/62;C12N15/63;C07K19/00;C12Q1/66;G01N21/64;C12R1/32
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及藥物高通量篩選模型的構(gòu)建方法，具體地說，涉及一種抗結(jié)核病藥物高通量篩選模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

結(jié)核病是一種死亡率較高的感染性疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康。全球約有三分之一的人感染了結(jié)核分枝桿菌，現(xiàn)有結(jié)核病人約2000萬，每年新發(fā)生約900萬病人，死亡人數(shù)高達(dá)300萬。我國作為22個(gè)結(jié)核病的高發(fā)國家之一，結(jié)核病人數(shù)僅次于印度，位居世界第二，每年死于結(jié)核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數(shù)總和的兩倍多。此外，感染了HIV的結(jié)核分枝桿菌攜帶者，由于病毒破壞了機(jī)體的免疫功能，發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且結(jié)核的病程發(fā)展更快，更易致死。結(jié)核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病負(fù)擔(dān)，成為威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。

由于耐藥及耐多藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，發(fā)展新型抗結(jié)核藥物，特別是抗耐藥結(jié)核藥物成為研究的重點(diǎn)，尋找抑制細(xì)菌生長的活性化合物是目前抗結(jié)核藥物研發(fā)的主要思路。現(xiàn)有的抗結(jié)核的一線藥物主要有利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺等，這些藥物多數(shù)是通過抑制結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁合成或蛋白合成等細(xì)菌生存所必需的環(huán)節(jié)，直接抑制細(xì)菌的生長或者殺死細(xì)菌。在藥物產(chǎn)生的生存壓力下，結(jié)核分枝桿菌通過突變作用靶點(diǎn)、增加藥物的外排、產(chǎn)生鈍化酶、改變膜的通透性等各種途徑，使原有的抗結(jié)核藥物逐漸失去效力，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新報(bào)告顯示，全球范圍內(nèi)幾種抗結(jié)核一線藥物的平均耐藥率依次為鏈霉素(6.3％)、異煙肼(5.6％)、利福平(1.4％)、乙胺丁醇(0.8％)。所以，盡管具有新作用機(jī)制的藥物可以有效抑制這些耐藥菌的生長，但如何從根本上解決“藥物-耐藥-新藥-耐新藥”這一循環(huán)性耐藥性問題，成為目前抗結(jié)核藥物研發(fā)的關(guān)鍵之一。

本發(fā)明選擇結(jié)核分枝桿菌生長非必需但與其致病性密切相關(guān)的ESX-1分泌系統(tǒng)為藥物靶點(diǎn)，探索利用低藥物選擇性的毒力因子為靶點(diǎn)發(fā)展抗結(jié)核藥物的新策略，突破以抑制結(jié)核分枝桿菌生長為目標(biāo)的傳統(tǒng)藥物研發(fā)思路，發(fā)展低藥物選擇壓力的致病性抑制劑，解決目前日趨嚴(yán)重的結(jié)核桿菌耐藥問題。

致病細(xì)菌將其毒力因子分泌到胞外，可以促進(jìn)細(xì)菌在宿主體內(nèi)的繁殖和擴(kuò)散并產(chǎn)生致病性。研究表明結(jié)核分枝桿菌的ESX-1分泌系統(tǒng)(VII型分泌系統(tǒng))介導(dǎo)多種毒力因子的分泌，在結(jié)核桿菌的致病性中起著關(guān)鍵作用。ESX-1分泌系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌的早期感染中發(fā)揮著重要的作用，參與結(jié)核分枝桿菌與宿主細(xì)胞早期的結(jié)合，引起細(xì)胞溶解，促進(jìn)肉芽腫的形成，抑制吞噬體成熟，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的相關(guān)免疫反應(yīng)，對(duì)減少感染的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌反應(yīng)起重要作用。ESX-1分泌系統(tǒng)主要由RD1(region?of?difference?1)區(qū)編碼。該基因區(qū)在非致病性結(jié)核分枝桿菌和BCG疫苗株中是缺失的。RD1區(qū)包括9個(gè)基因(Rv3871～Rv3879c)，是結(jié)核分枝桿菌重要的毒力因子。ESAT-6(early?secreted?antigenic?target?of?6kD，Rv3875)和CFP-10(culture?filtrate?protein?of?10kD，Rv3874)是最先被發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)由ESX-1分泌系統(tǒng)分泌的蛋白。這兩種蛋白能夠形成1∶1的二聚體結(jié)構(gòu)來發(fā)揮毒力效應(yīng)。ESAT-6是ESX-1分泌系統(tǒng)中一個(gè)重要的效應(yīng)分子，當(dāng)改變ESAT-6蛋白的個(gè)別氨基酸時(shí)不會(huì)抑制ESAT-6的分泌，但是會(huì)導(dǎo)致重組結(jié)核分枝桿菌毒力的減弱。CFP-10和ESAT-6的協(xié)同分泌是分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中增殖和抑制吞噬體成熟所必需的，其中C端起著重要的作用。CFP-10的C端具有信號(hào)序列能夠和細(xì)胞質(zhì)蛋白R(shí)v3871結(jié)合，信號(hào)序列位點(diǎn)的突變能夠阻止ESAT-6和CFP-10的分泌。Rv3869、Rv3870和Rv3877分別有1、3和11個(gè)轉(zhuǎn)膜位點(diǎn)，這3種蛋白同ESX-1分泌系統(tǒng)的Rv3871共同形成一個(gè)膜結(jié)合的ESX-1分泌復(fù)合體，通過ATP的水解轉(zhuǎn)運(yùn)分泌蛋白。研究表明，Rv3870、Rv3871和Rv3877的突變株對(duì)巨噬細(xì)胞的毒力減弱，并且在巨噬細(xì)胞的感染過程中引發(fā)弱化的免疫反應(yīng)。如果將完整的RD-1區(qū)整合入BCG菌株后，ESAT-6蛋白的ESX-1分泌系統(tǒng)依賴性分泌能夠恢復(fù)。這些均表明ESX-1分泌系統(tǒng)是結(jié)核分枝桿菌關(guān)鍵的致病因素。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是以結(jié)核分枝桿菌生長非必需但與其致病性密切相關(guān)的ESX-1分泌系統(tǒng)為藥物靶點(diǎn)，提供一種抗結(jié)核病藥物高通量篩選模型的構(gòu)建方法。