[發明專利]一種快速檢測液體乳中單增李斯特菌活菌的方法

無效

• 申請號: 201110165770.8
• 申請日: 2011-06-20
• 公開（公告）號: CN102277422A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 姜毓君;滿朝新;楊秀茹;盧雁;單藝;蔣亞男;王旻;謝鯤昊;胡惠秩;劉穎;薛玉清
• 申請（專利權）人: 黑龍江省乳品工業技術開發中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 韓末洙

技術領域

本發明涉及一種檢測單增李斯特菌活菌的方法。

背景技術

單核細胞增多性李斯特菌(Listeria?monocytogenes)，簡稱“單增李斯特菌”，是重要的食源性致病菌之一，分布廣泛，生存環境可塑性大，新生兒、孕婦和40歲以上的成人和免疫功能缺陷者易被感染，其致死率很高，WHO已將其列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一，因此，單增李斯特菌是許多國家食品中微生物檢測的必檢指標之一。

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated?Isothermal?Amplification，簡稱LAMP)發展迅速，其針對目的基因的六個區域設計4條特異引物(兩條外引物和兩條內引物)，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst?DNA?polymerase)在等溫條件下，1h內即可實現核酸的高效擴增，已廣泛用于單增李斯特菌的檢測。但是LAMP方法會同時擴增樣品中的死菌和活菌的DNA，不能有效區分死菌和活菌，易造成高估實際樣品中存在的活菌水平。

隨著中國經濟快速發展，人民對液體乳安全也備受關注，國家也加大了檢測液體乳中食源性致病菌的力度，但目前的分子生物學技術(PCR技術或LAMP技術)，都需要采用預增菌步驟(一般最增菌時間為8h～12h)，雖然能夠達到很低的檢出限，但是增加了檢測時間和檢測成本。所以現在還沒有一種快速檢測液體乳中單增李斯特活菌的方法。

發明內容

本發明是要解決現有的LAMP檢測方法不能有效區分死菌和活菌、傳統的液體乳中致病菌檢測方法存在檢測時間長，檢測成本高的問題，提供一種快速檢測液體乳中單增李斯特菌活菌的方法。

本發明快速檢測液體乳中單增李斯特菌活菌的方法，按以下步驟進行：一、受檢乳樣的前處理：向1mL受檢乳中加入PMA，使PMA的濃度為50μmol/L，然后置于暗處放置5～30min，接著置于距650W鹵素燈15～20cm處，曝光5～30min；二、樣品DNA的提取：向步驟一處理后的受檢乳中加入150μL濃度為250g/L的檸檬酸鈉和100μL濃度為1mol/L的氫氧化鈉，然后于10000r/min離心2min，棄上清，得沉淀；三、用質量濃度為0.85％的生理鹽水洗滌沉淀，然后于10000r/min離心1min，棄上清，用細菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，得提取物；四、以提取物作為模板進行LAMP擴增，得到LAMP擴增產物；五、鑒定：取5μL?LAMP擴增產物，點樣于質量濃度為2％的瓊脂糖凝膠中，以100V電壓在1×TAE電泳緩沖液中電泳30min，然后在凝膠成像系統中成像，即完成檢測。

本發明針對單增李斯特菌獨有的致病基因——hlyA基因來設計引物，進行LAMP擴增。本發明使用的熒光染料PMA(Propidium?Monoazide)結構中帶有一個疊氮基團(-N3)，在光激發下脫去(-N2)形成活躍的氮賓中間體，能插入死細胞DNA與其形成共價鍵(-NH-CH2-)，使DNA不能發生擴增反應，從而抑制LAMP擴增，可以有效區分死細菌和活細菌，避免造成對待測樣品中實際存活的單增李斯特菌含量的錯誤評估。

本發明的方法不需要預增菌步驟，能夠直接、快速的檢測出液體乳中單增李斯特活菌。本發明方法對儀器設備要求簡單，只需水浴條件即可完成，耗時較短，約1.5小時即可完成，大大縮短了檢測時間，可以顯著減少原料乳加工前和成品出廠前的等待檢測結果的儲藏時間。將本發明的電泳結果使用凝膠成像系統成像，能夠檢測出擴增條帶的即說明受檢乳中含有單增李斯特菌活菌。本發明的方法檢測靈敏度高，對單增李斯特菌活菌的檢出限為6.37×10¹cfu/mL。本發明為食品中致病菌的檢測開辟了新思路。

附圖說明

圖1為具體實施方式十一的檢測結果電泳圖；圖2為具體實施方式十一中PMA抑制單增李斯特死菌的LAMP擴增結果電泳圖；圖3為具體實施方式十一中靈敏度測試實驗的電泳圖。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。