[發明專利]誘導型神經干細胞的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201110164400.2
• 申請日: 2011-06-17
• 公開（公告）號: CN102827812A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 周琪;盛超;鄭欽元;王柳;李偉;趙小陽
• 申請（專利權）人: 中國科學院動物研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0797;C12N15/867;C12N5/071;C12Q1/02;A61L27/38
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

技術領域

本發明涉及誘導型神經干細胞的制備方法及應用，尤其涉及使細胞不經過多能性狀態，直接跨胚層轉分化細胞，快速高效的誘導型神經干細胞的制備方法及應用。

背景技術

人們對神經系統疾病的發生機制和治療手段關注度逐年上升。在當今社會科技進步一日千里，新藥開發層出不窮，但不可否認的是，全球范圍內神經系統類疾病患者數量與日俱增。諸如帕金森病、阿茲海默病等等神經退行性疾病已經嚴重降低了患者本人的生活質量，并且增加了患者家庭的生活負擔。所以，如何從根本上治療神經系統疾病，特別是神經退行性疾病已經成為各國學者角逐的熱點，我國也十分重視該領域的研究探索。神經退行性疾病的傳統治療手段主要是藥物治療。然而，實際臨床中藥物治療多半會引發嚴重的并發癥(Willis，G.L.，The?therapeutic?effects?of?dopamine?replacement?therapy?and?its?psychiatric?side?effects?are?mediated?by?pineal?function.Behav?Brain?Res，2005.160(1)：p.148-60.)。神經退行性疾病產生的原因多是腦內特定區域某種神經元大量凋亡。研究發現哺乳動物包括人類，神經系統的再生能力很差，所以未來有效治療神經退行性疾病依賴于神經干細胞或神經元的細胞移植。由于手術需要大量符合臨床標準的神經細胞，所以開發一種可靠的細胞資源尤為重要。多能性胚胎干細胞可以分化為各種類型的神經細胞，但是誘導效率很低，移植后有致瘤風險?？紤]到手術后的臨床并發癥和社會倫理問題，用患者自體的神經組織進行細胞移植更具有應用價值(Chen，Z.and?T.D.Palmer，Cellular?repair?of?CNS?disorders：an?immunological?perspective.Hum?Mol?Genet，2008.17(R1)：p.R84-92.)。之前的研究表明，在體細胞中過表達某些重要基因，可以獲得與原來供體細胞遺傳背景一致的誘導多能性干細胞(iPSCs)(Takahashi，K.and?S.Yamanaka，Induction?of?pluripotent?stem?cells?from?mouse?embryonic?and?adult?fibroblast?cultures?by?defined?factors.Cell，2006.126(4)：p.663-76.)和誘導型神經元(iNs)(Vierbuchen，T.，et?al.，Direct?conversion?of?fibroblasts?tofunctional?neurons?by?defined?factors.Nature.463(7284)：p.1035-41)。雖然iPSCs細胞可以源源不斷的產生神經前體細胞，但是移植后產生的致瘤性問題制約了這類多能性干細胞的臨床應用(Wer?nig，M.，et?al.，Neurons?derived?from?reprogrammed?fibroblasts?functionally?integrate?into?the?fetal?brain?and?improve?symptoms?of?ratswith?Parkinson′s?disease.Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A，2008.105(15)：p.5856-61.)。相反，iNs細胞完全不能進行細胞分裂，所以移植回病患處后很難體內存活。除此之外，之前研究得到的iNs細胞只能是一類外周神經元，通過直接誘導手段獲得其它類型神經元暫時未見報道。

為了達到更加安全有效的臨床效果，開發一種可靠穩定獲得神經干細胞的誘導方法非常急迫。

發明內容

因此，本發明的目的是提供一種可以使細胞不經過多能性狀態，直接跨胚層轉分化睪丸支持細胞，快速高效的誘導型神經干細胞(iNSCs)的制備方法，并且證明這種通過重編程方式獲得的神經干細胞在體內或者體外都具有生理學功能，這類細胞比之前用于移植的多能性干細胞更加安全。

本發明的制備誘導型神經干細胞的方法，包括將外源因子Ascl1、Neurog2、Pax6、Hes1、Id1、Brn2、c-Myc和Klf4在睪丸支持細胞中過表達，然后在含有細胞生長因子的基礎培養液中培養，獲得誘導型神經干細胞。

優選地，本發明的制備誘導型神經干細胞的方法中，所述細胞生長因子為EGF和bFGF。

優選地，本發明的制備誘導型神經干細胞的方法中，所述EGF和所述bFGF均為20納克/毫升。