[發(fā)明專利]誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110164400.2
• 申請日: 2011-06-17
• 公開（公告）號: CN102827812A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周琪;盛超;鄭欽元;王柳;李偉;趙小陽
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0797;C12N15/867;C12N5/071;C12Q1/02;A61L27/38
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

1.一種制備誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞的方法，包括將外源因子Ascl1、Neurog2、Pax6、Hes1、Id1、Brn2、c-Myc和Klf4在睪丸支持細(xì)胞中過表達(dá)，然后在含有細(xì)胞生長因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲得誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞生長因子為EGF和bFGF。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述EGF和所述bFGF均為20納克/毫升。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為N2B27培養(yǎng)液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)在D型多聚賴氨酸和層粘連蛋白包被的的培養(yǎng)皿中進(jìn)行。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述外源因子Ascl1、Neurog2、Pax6、Hes1、Id1、Brn2、c-Myc和Klf4在睪丸支持細(xì)胞中過表達(dá)的方法為：將外源因子Ascl1、Neurog2、Pax6、Hes1、Id1、Brn2、c-Myc和Klf4的cDNA分別克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，獲得重組載體，將所述重組載體包裝成病毒，利用所述病毒感染睪丸支持細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述病毒感染睪丸支持細(xì)胞按照如下步驟進(jìn)行：

200,000個(gè)所述病毒感染睪丸支持細(xì)胞中，加入每種外源因子的濃縮病毒，同時(shí)加入含4微克/毫升的聚凝胺的睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液，感染24小時(shí)，然后換成正常的睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液，恢復(fù)培養(yǎng)24小時(shí)，重復(fù)感染、恢復(fù)培養(yǎng)一次。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述睪丸支持細(xì)胞按照如下步驟制備：

去掉睪丸的白膜，然后分三步進(jìn)行消化：(一)0.1％膠原酶IV?37℃消化20分鐘；(二)同時(shí)用0.1％膠原酶IV和0.1％透明質(zhì)酸酶37℃消化10分鐘，消化后以PBS清洗；(三)，0.1％膠原酶IV、0.1％透明質(zhì)酸酶、0.25％胰酶、0.04％DNA酶I的混合物，37℃消化20分鐘，用胎牛血清終止消化，200目的細(xì)胞篩過濾細(xì)胞，再用DMEM/F12培養(yǎng)液清洗兩次，培養(yǎng)在睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液中，睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液的成分是：DMEM/F12，10％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法制備的誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞。

10.權(quán)利要求9所述的誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。