[發(fā)明專利]CryIAc蛋白標準物質(zhì)定值的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110163446.2
• 申請日: 2011-06-17
• 公開（公告）號: CN102353726A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋德偉;劉思謙;武利慶;畢佳明;王晶;楊彬
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京雙收知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新;解政文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種標準物質(zhì)的定值方法，尤其是涉及一種殺蟲晶體蛋白CryIAc標準物質(zhì)定值的方法。

背景技術(shù)

對通過均勻性、穩(wěn)定性檢驗合格樣料的特性值進行測量，在標準物質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域稱為表征化(原文為characterize，即對材料特性進行測量)；由計量權(quán)威部門對表征化獲得的樣料特性的量值進行計量學溯源性(以下簡稱溯源性)確認和相應(yīng)測量不確定度評定合理性確認，在標準物質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域稱為定值(原文為certify，即對測量獲得的結(jié)果進行認證確認，在其它技術(shù)領(lǐng)域一般稱為認證)。因此，對有證標準物質(zhì)的定值，實際上應(yīng)分為兩步：首先是對經(jīng)過均勻性、穩(wěn)定性檢驗合格的樣料特性值進行測量，也就是表征化；然后是對測量結(jié)果的溯源性和測量不確定度評定的合理性進行有效性確認。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性菌，廣泛存在于土壤、塵埃、水域、沙漠、植物、昆蟲尸體中(賈士榮等，2001)。1901年，日本學者石渡從染病的家蠶體液中首次分離出Bt菌，并證明部分Bt對鱗翅目昆蟲有殺蟲活性。1915年，Berliner注意到Bt在芽胞形成過程中，其一端出現(xiàn)小的包含物，但不知殺蟲活性與此有關(guān)。二十世紀50年代，人們才發(fā)現(xiàn)Bt菌的殺蟲活性與伴胞晶體有關(guān)(Hannay，1953)，并證實這種伴胞晶體由蛋白質(zhì)組成(Hannay?and?Fitz-James，1955)。這種蛋白通常被稱作δ-內(nèi)毒素(δ-endotoxins)或殺蟲晶體蛋白(insecticidal?crystal?protein，ICP)。1989年Hofte和Whiteley根據(jù)晶體蛋白的氨基酸序列和殺蟲譜的不同，將已經(jīng)發(fā)表的42種晶體蛋白分為5群14亞類。其中具有溶血溶細胞作用的27kDa晶體蛋白基因被命名為Cyt基因，其他只有殺蟲活性的13亞類命名為狹義的晶體蛋白基因，即Cry基因。Cry基因可劃分四群，即CryI為鱗翅目特異性，Cry?II為鱗翅目和雙翅目特異性，CryIII為鞘翅目特異性，CryIV雙翅目特異性。CryI是研究的最多的一類Bt殺蟲晶體蛋白，目前常見的轉(zhuǎn)Bt基因是CryIA(b)、(c)，Cry9c。BT晶體蛋白具有高特異的殺蟲活性，是近年來應(yīng)用最為廣泛的生物殺蟲劑。在實際檢測工作中，經(jīng)常需要對待檢測轉(zhuǎn)基因作物進行CryIAc蛋白定性和定量檢測，但是對于其標準物質(zhì)定值是否準確的研究現(xiàn)在還很少。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是填補上述技術(shù)空白，提供一種CryIAc蛋白標準物質(zhì)定值的方法，具有良好的準確性、可靠性和追溯性。

上述定值方法，包括以下步驟：

(1)合成兩條特異性肽段：LIGNYTDYAVR、IVAQLGQGVYR用于進行CryIAc蛋白定量；

(2)同時使用全氘標記的亮氨基合成對應(yīng)的兩條同位素標記肽段；

(3)以亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸標準物質(zhì)為標準，以同位素標記亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸為內(nèi)標，采用同位素稀釋質(zhì)譜法對合成的兩條標準肽段進行準確定量；

(4)按400μL溶液中所含CryIAc蛋白質(zhì)量，根據(jù)兩條肽段的純度計算酶切后所得兩條目標肽段的質(zhì)量，配制相應(yīng)濃度標準肽段及同位素內(nèi)標肽段；

(5)準確稱量400μL?CryIAc蛋白溶液，加入并稱量相應(yīng)體積的同位素內(nèi)標溶液；使酶切后所得目標肽段與內(nèi)標肽段摩爾比為1∶1；

(6)離心干燥上述已加入內(nèi)標的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液對蛋白進行變性處理；10min后加入2μL?1M的二硫蘇糖醇(DTT)溶液在60攝氏度水浴中加熱60min；然后加入2μL?1M的碘乙酰胺(IAA)，在暗處反應(yīng)40min；加入6μL?1M的二硫蘇糖醇還原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氫胺溶液稀釋尿素至1M以下，加入2μL?0.5mg/mL的胰蛋白酶(Trypsin)溶液進行酶切，每24小時補充2μL的Trypsin；酶切84小時后采用同位素稀釋質(zhì)譜法對兩條肽段進行準確定量；

(7)根據(jù)質(zhì)譜所得酶切后肽段與同位素肽段的比例配制標準肽段與內(nèi)標肽段比例的標準曲線；計算溶液中肽段含量，根據(jù)蛋白的分子量計算每400μL溶液中CryIAc蛋白的濃度作為標準物質(zhì)的定值結(jié)果。

其中本發(fā)明中使用的CryIAc標準物質(zhì)制備過程：

(1)配制濃度為0.1％的氨水溶液，用于溶解經(jīng)過純化的CryIAc。

(2)配制濃度為50μg/g?CryIAc溶液。