[發(fā)明專利]CryIAc蛋白標準物質(zhì)定值的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201110163446.2 | 申請日： | 2011-06-17 |
| 公開（公告）號： | CN102353726A | 公開（公告）日： | 2012-02-15 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 宋德偉;劉思謙;武利慶;畢佳明;王晶;楊彬 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國計量科學(xué)研究院 |
| 主分類號： | G01N30/02 | 分類號： | G01N30/02;G01N30/06 |
| 代理公司： | 北京雙收知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241 | 代理人： | 盧新;解政文 |
| 地址： | 100013 *** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | cryiac 蛋白 標準 物質(zhì) 方法 | ||
1.一種CryIAc蛋白標準物質(zhì)定值的方法，其特征在于：包括以下步驟：
(1)合成兩條特異性肽段：LIGNYTDYAVR、IVAQLGQGVYR用于進行CryIAc蛋白定量；
(2)同時使用全氘標記的亮氨基合成對應(yīng)的兩條同位素標記肽段；
(3)以亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸標準物質(zhì)為標準，以同位素標記亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸為內(nèi)標，采用同位素稀釋質(zhì)譜法對合成的兩條標準肽段進行準確定量；
(4)按400μL溶液中所含CryIAc蛋白質(zhì)量，根據(jù)兩條肽段的純度計算酶切后所得兩條目標肽段的質(zhì)量，配制相應(yīng)濃度標準肽段及同位素內(nèi)標肽段；
(5)準確稱量400μL?CryIAc蛋白溶液，加入并稱量相應(yīng)體積的同位素內(nèi)標溶液；使酶切后所得目標肽段與內(nèi)標肽段摩爾比為1∶1；
(6)離心干燥上述已加入內(nèi)標的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液對蛋白進行變性處理；10min后加入2μL?1M的二硫蘇糖醇溶液在60攝氏度水浴中加熱60min；然后加入2μL?1M的碘乙酰胺，在暗處反應(yīng)40min；加入6μL?1M的二硫蘇糖醇還原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氫胺溶液稀釋尿素至1M以下，加入2μL?0.5mg/mL的胰蛋白酶溶液進行酶切；酶切84小時后采用同位素稀釋質(zhì)譜法對兩條肽段進行準確定量；
(7)根據(jù)質(zhì)譜所得酶切后肽段與同位素肽段的比例配制標準肽段與內(nèi)標肽段比例的標準曲線；計算溶液中肽段含量，根據(jù)蛋白的分子量計算每400μL溶液中CryIAc蛋白的濃度作為標準物質(zhì)的定值結(jié)果。
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