[發明專利]一株生產莽草酸的重組大腸桿菌及其構建方法

無效

• 申請號: 201110163364.8
• 申請日: 2011-06-17
• 公開（公告）號: CN102250874A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 方宏清;鄒永康;陳凱;孫旭;蔡釩;戴紅梅;李樹龍;周長林
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所;中國藥科大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63;C12N1/21;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種莽草酸生產菌株及其構建方法。?

背景技術

莽草酸(shikimic?acid)是生物合成芳香族氨基酸的通路即莽草酸途徑的重要中間體，已報道的生理功能有：通過影響花生四烯酸代謝來抑制血小板聚集，從而可以抑制動、靜脈血栓及腦血栓形成；具有抗炎、鎮痛作用；還可作為抗病毒和抗癌藥物的中間體，有廣泛的藥用價值等等。其化學名稱為3，4，5-三羥基-1-環己烯-1-羧酸，化學結構式如下：?

目前用以治療H5N1型禽流感病毒的特效藥物為磷酸奧司他韋(oseltamivir?phosphate)，商品名為達菲，而莽草酸正是抗禽流感藥物“達菲”合成的關鍵手性起始原料。目前生產所需莽草酸大部分來自于中國廣西的木蘭科植物---八角，但是此種生產工藝復雜，得率較低，且原料易受季節、氣候等因素限制，難以滿足大規模生產所需，瑞士羅氏公司擁有此種達菲生產的專利權，價格昂貴。?

因此，對微生物芳香族氨基酸代謝流改造以提高莽草酸產量具有廣闊前景。微生物生長所需的原材料如葡萄糖等隨時可獲得，其繁殖速度快，代謝能力強，故而周期短，且生產過程對環境污染小，成本低廉，相比于植物提取具有很大的優勢。故而通過生物手段改造工程菌從而使之大量生產莽草酸具有很重要的經濟、社會效益。?

發明內容

本發明的目的在于通過基因工程的方法對大腸桿菌CCM(central?carbon?metabolism)及莽草酸途徑進行改造，從而提供一種新的莽草酸的生產菌株。?

本發明的另一個目的在于提供所述的莽草酸生產菌株的構建方法。?

本發明的莽草酸生產菌株的構建方法包括以下步驟：?

(1)、構建敲除ptsHIcrr操縱子、ydiB、shiA、aroL和aroK基因以及整合T7RNA聚合酶的大腸桿菌DHPYASA-T7。?

(2)、構建含有T7啟動子的莽草酸代謝途徑中的關鍵基因tktA、glk、aroE、aroF以及aroB的重組表達質粒pAOC-TGEFB。?

(3)、將重組表達質粒pAOC-TGEFB轉化改造菌株DHPYASA-T7獲得莽草酸的生產菌株DHPYAS-T7。?

本發明所述菌株與國內外現有專利相比，創新之處在于以下兩點：?

(1)、敲除ptsHIcrr操縱子基因，提高莽草酸途徑前體PEP的供給。ptsHIcrr基因敲除或突變解除了“分解物代謝阻遏現象”，能更有效地利用復合培養基水解產物來維持菌體生長，PTS系統缺失菌株依賴GalP及Glk以ATP提供的磷酸基進行葡萄糖磷酸化轉運，該葡萄糖轉運系統提高胞內PEP的利用率，有利于增加碳流進入芳香族氨基酸途徑；?

(2)、敲除ydiB基因提高莽草酸產量。YdiB是一種雙功能酶(奎尼酸/莽草酸脫氫酶)，與奎尼酸(QA)代謝緊密相關，ydiB基因敲除后菌株缺乏奎尼酸脫氫酶活性，三脫氫奎尼酸(DHQ)合成QA途徑受阻，副產物QA產量下降，DHQ得到積累并在脫氫奎尼酸脫水酶催化下合成大量三脫氫莽草酸(DHS)；而莽草酸脫氫酶活性可以通過aroE基因的過表達得到補償，高濃度的DHS作為莽草酸脫氫酶的底物，高效合成莽草酸，目的產物產量顯著提高；?

本發明所構建的莽草酸生產菌株DHPYAS-T7已于2011年03月03日提交位于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?NO.4631。?

利用本發明所獲得的基因工程菌株DHPYAS-T7進行發酵，可以有效獲得目的產物莽草酸的積累，從而為莽草酸生物合成的產業化奠定了基礎。?

附圖說明

圖1為ptsHIcrr基因敲除策略，其中L為大腸桿菌中ptsHIcrr上游同源基因，R為ptsHIcrr下游同源基因。?

圖2為DH5αΔptsHIcrr敲除菌DHP的PCR鑒定，顯示ptsHIcrr基因已被成功敲除；其中M為DNA?marker；1，2為野生型大腸桿菌DH5α；3為ptsHIcrr敲除菌。?

圖3為pET-28a-YLR/DH5α陽性菌鑒定結果；其中M為DNA?Marker，11-20為經pET-28a-YLR轉化后的大腸桿菌不同單菌落進行PCR鑒定的結果，結果顯示11-14、16、19均為陽性條帶。?