[發明專利]級聯侵入信號放大反應結合納米金-寡核苷酸探針可視化核酸檢測方法

有效

• 申請號: 201110161736.3
• 申請日: 2011-06-16
• 公開（公告）號: CN102827922A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 周國華;馬寅姣;鄒秉杰
• 申請（專利權）人: 華東醫學生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 夏平;李曉峰

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及核酸侵入信號放大方法與納米金-寡核苷酸探針。具體涉及一種級聯侵入信號放大反應結合納米金-寡核苷酸探針可視化核酸檢測方法。

背景技術

核酸檢測已經廣泛應用于臨床診斷、環境監測以及傳染性疾病的預防與控制等很多方面。目前常用的核酸檢測技術大多基于模板擴增原理，即擴增產物與靶核酸序列相同，如聚合酶鏈式反應技術(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)、環介導的核酸等溫擴增技術(Loop-MediatedIsothermal?Amplification，LAMP)、滾環擴增技術(Rolling?Cycle?Amplification，RCA)、基于核酸序列擴增技術(Nucleic?Acid?Sequence?Based?Amplification，NASBA)、轉錄酶介導的擴增技術(Transcription?Mediated?Amplification，TMA)、解鏈酶擴增技術(Helicase?DependantAmplification，HDA)、鏈置換擴增技術(Strand?Displacement?Amplification，SDA)等。上述核酸擴增方法由于擴增產物與靶核酸序列相同，因此極易造成產物交叉污染，使核酸檢測經常出現假陽性的結果。

為了避免擴增產物的交叉污染，近年來發展了一些不擴增靶核酸，而是由靶核酸引發其他信號分子擴增，間接地對靶核酸進行檢測的核酸信號擴增檢測方法，如分枝DNA法(Branch-DNA，B-DNA)、核酸侵入信號擴增實驗(Invader?Assay)以及一些基于電化學檢測的信號擴增法。其中，B-DNA法及核酸侵入信號擴增實驗均有較高的靈敏度，但它們都需要合成特殊結構或特殊熒光標記的探針，提高了檢測成本；而基于電化學檢測的信號擴增法往往靈敏度較低，達不到核酸檢測的要求。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種基于信號放大和納米金-寡核苷酸探針的可視化核酸檢測方法，即提供一種級聯侵入信號放大反應結合納米金-寡核苷酸探針可視化核酸檢測方法。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

本發明利用納米金-寡核苷酸探針，可視化檢測級聯侵入信號放大反應結果，建立了一種高靈敏度的可視化的核酸檢測方法。

本方法依次包括以下步驟(反應原理如圖2所示)：

(1)級聯侵入信號放大反應的第一步核酸侵入信號擴增階段：設計針對靶核酸特異性的一對探針，要求與靶核酸雜交后，上游探針3’端必須侵入下游探針1個堿基，下游探針有一段翹起片段，稱為5’flap，并且其中下游探針與靶核酸互補區域的解鏈溫度在核酸5’外切酶或5’flap內切酶的酶切反應溫度±1℃范圍內，而上游探針與靶核酸互補區域的解鏈溫度要高于核酸5’外切酶或5’flap內切酶的酶切反應溫度5～10℃；所述的靶核酸與所述的上、下游探針在核酸侵入反應體系中雜交形成探針-靶核酸特異性結構，其中下游探針濃度大于上游探針濃度；向反應體系中加入核酸5’外切酶或5’flap內切酶，核酸5’外切酶或5’flap內切酶識別所述的探針-靶核酸特異性結構，并將下游探針的5’flap連同與模板配對的第一個堿基切下，因為所述的酶切反應溫度接近下游探針與模板配對部分的熔解溫度，下游探針被切割后會很快與靶核酸分離，沒有被切割的完整的下游探針會再次與靶核酸雜交，而上游探針熔解溫度高于反應溫度，可以牢固地結合在靶核酸上，與新雜交的完整的下游探針再次形成所述的探針-靶核酸特異性結構，進而繼續被核酸5’外切酶或5’flap內切酶切割，形成flap片段的積累；

(2)級聯侵入信號放大反應的flap片段循環信號擴增階段：反應體系中的發卡探針可捕獲步驟(1)積累的flap片段，并雜交形成一個flap片段-發夾探針特異性結構，該結構也可被反應體系中的核酸5’外切酶或5’flap內切酶識別，并將發夾探針的5’flap連同與模板配對的第一個堿基切下，被切割的發夾探針與步驟(1)產生的flap片段分離，沒有被切割的完整的發夾探針會再次與步驟(1)產生的flap片段雜交，再次形成所述的flap片段-發夾探針特異性結構，進而繼續被核酸5’外切酶或5’flap內切酶切割，從而大量的發夾探針被切割；